MicroRNA-let-7c对中耳胆脂瘤细胞凋亡的调控作用及分子机制研究

发布时间：2018-09-10 09:55

【摘要】：中耳胆脂瘤是一种在中耳和乳突腔内的非肿瘤的疾病,其病理学特征包括鳞状上皮角化功能受损、上皮增生的同时伴有异常的上皮内细微结构的变化如微胆脂瘤的形成、基底膜的破坏、断裂,胆脂瘤上皮下组织炎性细胞的浸润等。临床表现主要有耳痛、流脓、听力下降,严重的可波及面神经引起面瘫、波及半规管导致眩晕及颅内外的感染危及生命,而这一切的原因都是胆脂瘤对临近骨质的破坏吸收所致。目前胆脂瘤发生发展的机制尚不明确。从分子生物学上研究发现多种因素,如增生、凋亡、分化、炎症、感染、骨质破坏、脂类代谢、血管发生在胆脂瘤的形成和临床表现方面有着一定的作用,其中增生、分化和凋亡的异常表现是胆脂瘤上皮的最基本特征。研究多以与正常皮肤上皮的生物学特性相比较,发现胆脂瘤上皮增殖的能力异常增高,这种高度的增殖同肿瘤细胞是类似的已达成共识,目前分歧最大的地方是关于凋亡,包括凋亡能力、凋亡发生的途径及凋亡的意义。细胞凋亡(apoptosis)是一种自主性死亡过程,由特定基因控制,在多种病理生理过程中是不可缺少的。一些学者认为胆脂瘤上皮细胞的凋亡能力增加,过度凋亡导致的胆脂瘤上皮脱落形成的角化物的聚集同胆脂瘤的发生发展有关,而且凋亡水平的变化同胆脂瘤的骨质吸收与复发、残留有关,而另一些研究的结果则倾向于胆脂瘤上皮细胞中凋亡能力受到了阻滞,导致凋亡周期延长,细胞存在抗凋亡(anti-apoptosis)作用。研究发现,细胞增殖、分化和死亡、迁移等多种生物学过程均受一类长20-30nt的小RNA分子即Micro(mi)RNA的调控,mi RNA可以通过沉默其靶基因表达来发挥调控作用,其作用方式是与靶基因m RNA3’端非翻译区里的特异的结合位点结合。多项研究表明,肿瘤的发生发展及预后同mi RNA的作用密切相关,同时mi RNA在多种异常增生性疾病和代谢性疾病中也发生了明显的变化。Friedland等以耳后皮肤组织为对照,采用RT-PCR技术首次检测到八种mi RNAs在胆脂瘤组织中的表达发生上调,其中mi RNA-21的表达量改变最高,平均高于对照组4.4倍,其下游靶基因为PTEN和PDCD。2011年陈晓华研究了胆脂瘤上皮增殖和凋亡的相互关系,结果发现,凋亡相关mi RNA(apoptotic-associated mi RNA)let-7a在胆脂瘤上皮表达上调。Let-7 micro RNA家族是目前研究最广泛的micro RNA之一,在调控细胞的增殖和凋亡方面均有作用途径参与。在大多数肿瘤呈现低表达,提示let-7 micro RNA的功能抑制与肿瘤的凋亡能力下降密切相关,而其在胆脂瘤中的高表达提示其对胆脂瘤细胞的调控模式显然不同于在肿瘤细胞中的作用方式。2015年张文静从Let-7a micro RNA对胆脂瘤细胞增生的影响进行研究,发现Let-7a micro RNA通过抑制mi RNA-21的作用而影响了细胞的增生,然而从mi RNA水平研究胆脂瘤凋亡以及let-7 micro RNA参与中耳胆脂瘤凋亡的调控作用及具体途径的研究国内外尚未见报道。相对于成人胆脂瘤来说,小儿胆脂瘤通常具有更强的攻击性、侵袭性和复发性,既往研究表明凋亡的差异与胆脂瘤骨质破坏、复发有关,因而凋亡在上述两种胆脂瘤中的表现有无差异以及mi RNA在其中起到的作用如何值得进一步研究。本研究目的1.观察儿童胆脂瘤和成人胆脂瘤的凋亡能力的差异以及mi RNA-let-7c及其靶蛋白Bcl-xl在两种胆脂瘤中的表达情况,研究mi RNA-let-7c与凋亡在胆脂瘤发生中的作用。2.以携带mi RNA-let-7c抑制体的慢病毒载体感染培养的胆脂瘤上皮角质细胞,观察下调mi RNA-let-7c对胆脂瘤角质细胞中mi RNA-let-7c及其靶基因Bcl-xl表达情况以及对细胞凋亡能力的影响。3.观察mi RNA-let-7c inhibitor干扰胆脂瘤细胞凋亡的具体途径,以期阐明胆脂瘤中mi RNA-let-7c介导凋亡的发生机制,为我们认识mi RNA在中耳胆脂瘤发生、发展过程中的作用提供新的理论依据。第一部分mi RNA-let-7c在儿童胆脂瘤和成人胆脂瘤组织中的表达研究方法1.利用TUNEL法检测29例儿童中耳胆脂瘤(年龄≤14岁)、29例成人中耳胆脂瘤(年龄≥18岁)的凋亡的差异,同时以相应的儿童、成人耳后正常皮肤组织作为对照。2.提取29例成人胆脂瘤组织、29例儿童胆脂瘤组织和耳后皮肤组织中的m RNAs,其浓度和纯度的检测通过紫外分光光度仪获得。3.利用RT-PCR技术检测儿童胆脂瘤、成人胆脂瘤组织和其对照组中mi RNA-let-7c的表达。4.采用免疫印迹技术检测中耳胆脂瘤组织及对照组中Bcl-xl蛋白的表达。结果1.胆脂瘤上皮的凋亡同耳后皮肤组织相比,凋亡显著高于皮肤组(P0.05);成人中耳胆脂瘤上皮的凋亡能力高于儿童胆脂瘤(P0.05);两组耳后正常皮肤组织间的凋亡无差异(P0.05)。2.成人胆脂瘤组织中mi RNA-let-7c的表达是对照组的11.96±0.09倍(P0.05);儿童胆脂瘤组织中mi RNA-let-7c的表达是对照组的7.94±0.04倍(P0.05);儿童和成人胆脂瘤间mi RNA-let-7c的表达差异也有统计学差异(P0.05);mi RNA-let-7c在两组耳后皮肤上皮间的相对表达量无差异(P0.05)。3.Mi RNA-let-7c下游靶基因Bcl-xl在两种胆脂瘤中均呈现低表达,在成人胆脂瘤中的表达更低(P0.05)。第二部分下调mi RNA-let-7c对胆脂瘤角质细胞中mi RNA-let-7c及其靶基因的表达以及细胞凋亡的影响方法1.采用两步消化法获取中耳胆脂瘤上皮角质细胞,在无血清培养基中进行培养。通过显微镜下观察细胞形态并进而利用角质细胞角蛋白抗体行免疫荧光化学方法检测对角质细胞的性质进行鉴定。2.实验分组:mi R-let-7c-inhibitor组(实验组),mi R-let-7c-inhibitor NC组(阴性对照组),Mock组(空白对照组)。3.利用携带mi RNA-let-7c inhibitor的慢病毒载体和mi RNA-let-7c inhibitor NC的慢病毒载体感染胆脂瘤角质细胞,同时以空白对照组作为对照,培养后在荧光显微镜下观察病毒感染效率,利用RT-PCR技术检测mi RNA-let-7c的表达是否下调。4.利用western blotting和RT-PCR技术检测mi R-let-7c inhibitor干扰对胆脂瘤角质细胞中Bcl-xl蛋白和m RNA表达的影响。5.将感染mi RNA-let-7c inhibitor慢病毒后的胆脂瘤角质细胞、阴性对照组和空白对照组细胞接种于96孔板中,共培养10天,每天取3孔通过检测OD值,绘制生长曲线。6.如上方法处理胆脂瘤细胞96h后,三组细胞均进行碘化丙啶染色30分钟后,用FCM法测定细胞凋亡及周期的改变。7.如上方法处理胆脂瘤细胞96h后利用Annexin V-FITC染色法观察细胞早期凋亡状况,TUNEL原位酶标记在荧光显微镜下观察胆脂瘤细胞的凋亡。结果1.两步消化法之后采用无血清培养基培养可获得足够数量的胆脂瘤上皮角质细胞,利用角蛋白抗体检测提取获得的胆脂瘤角质上皮细胞的纯度可达90%以上,可用于后续实验。2.Mi R-let-7c-inhibitor组的胆脂瘤角质细胞中mi RNA-let-7c的表达显著低于mi R-let-7c-NC组和Mock组,mi RNA-let-7c在mi R-let-7c-NC组中的表达是mi R-let-7c-inhibitor组的10.19±0.26倍,在Mock组中的表达是mi R-let-7c-inhibitor组的10.92±0.31倍,差异均有统计学意义(P0.05),而在mi R-let-7c-NC组和Mock组中的表达无差异(P0.05)。3.Bcl-xl蛋白在胆脂瘤角质细胞mi R-let-7c-inhibitor组的表达较mi R-let-7c-NC组和Mock组明显升高,差异有统计学意义(P0.05);在mi R-let-7c-NC组和Mock组中的表达无明显差异(P0.05)。而Bcl-xl m RNA在mi R-let-7c-inhibitor组的表达同mi R-let-7c-NC组和Mock组相比无统计学差异(P0.05)。4.Mi RNA-let-7c inhibitor干扰后胆脂瘤上皮角质细胞生长速度较两对照组明显增快,第5天mi R-let-7c-inhibitor组的OD值与mi R-let-7c-NC组和Mock组比较差异有统计学意义(P0.05),第9天时mi R-let-7c-inhibitor组因细胞密度过大,死亡细胞增多。5.Mi RNA-let-7c inhibitor感染胆脂瘤角质细胞96h后,凋亡细胞比例下降,同mi R-let-7c-NC组和Mock组相比,差异有统计学意义(P0.05)。细胞周期分布出现明显改变,S期细胞的数量增多(P0.05),G0/G1期细胞比例的下降(P0.05),即mi RNA-let-7c inhibitor促使胆脂瘤角质细胞从G0/G1期进入S期。6.Mi RNA-let-7c inhibitor感染后96h,Annexin V-FITC检测胆脂瘤角质细胞的早期凋亡率明显减少(P0.05);TUNEL法检测胆脂瘤角质细胞凋亡比例也明显减少(P0.05)。第三部分mi RNA-let-7c参与胆脂瘤上皮角质细胞凋亡的分子机制研究方法1.利用western blotting检测胆脂瘤组织及耳后皮肤组织中Bax、cytochrome C、smac、caspase-3和caspase-9的表达。2.利用携带mi RNA-let-7c inhibitor的慢病毒载体感染胆脂瘤角质细胞,实验分组:mi R-let-7c-inhibitor组(实验组),mi R-let-7c-NC组(阴性对照组),Mock组(空白对照组)。3.如上方法处理胆脂瘤细胞72小时后利用western blotting检测mi R-let-7c inhibitor干扰对胆脂瘤角质细胞中线粒体凋亡途径相关蛋白Bax、pro-caspase-3、pro-caspase-9和cytochrome C、Smac蛋白表达的影响。4.如上方法处理胆脂瘤细胞96小时后进行JC-1染色,之后检测三组细胞线粒体膜电位的差异。5.如上方法处理胆脂瘤细胞96小时后利用分光光度仪检测caspase-3和caspase-9的活性。结果1.胆脂瘤组织同耳后皮肤组织相比,Bax、cytochrome C、smac、caspase-3和caspase-9的表达均增加。2.Mi RNA-let-7c inhibitor感染胆脂瘤角质细胞72h后Bax、cytochrome C、Smac的表达明显减少(P0.05),而pro-caspase-3、pro-caspase-9的表达明显增加,差异有统计学差异(P0.05)。3.Mi RNA-let-7c inhibitor感染胆脂瘤角质细胞96h后线粒体膜电位检测中绿色荧光值明显下降,表明线粒体膜电位上升(P0.05)。4.Mi RNA-let-7c inhibitor感染胆脂瘤角质细胞96h后caspase-3和caspase-9的活性明显降低(P0.05)。结论1.中耳胆脂瘤凋亡水平升高和mi RNA-let-7c的表达上调,从mi RNA水平验证了胆脂瘤的高凋亡状态的非肿瘤性质。2.Mi RNA-let-7c及其靶基因Bcl-xl和凋亡在儿童胆脂瘤和成人胆脂瘤中的表达有差异,这种差异提示儿童胆脂瘤的抗凋亡机制参与到了其发病机制中。3.Mi RNA-let-7c inhibitor慢病毒可有效沉默胆脂瘤角质细胞中mi RNA-let-7c的表达,通过在翻译水平的负性调控机制使其靶基因Bcl-xl蛋白的表达升高。4.Mi R-let-7c通过阻断细胞周期促进细胞凋亡,且以早中期细胞凋亡为主。5.Mi RNA-let-7c通过提高Bax/Bcl-xl比率,使线粒体膜电位降低,促进Cyt c、Smac释放入胞浆进而激活一系列caspase蛋白酶通过线粒体途径导致细胞凋亡。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R764.21

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