表达三种活化型生长因子细胞系的建立及其内耳诱导分化作用的实验研究

发布时间：2018-10-18 08:09

【摘要】：背景：感音神经性耳聋是一种常见的感觉障碍性疾病,其中先天性重度感音神经性耳聋的发生率约为千分之一,严重困扰着人类的健康、生活与交流。但是,现有的治疗手段却很有限,主要是助听器和电子耳蜗植入。助听器对于中度的耳聋有一定效果,但实际上只有五分之一的人才能从中获益。对于重度感音神经性聋,主要依靠电子耳蜗植入,通过插入耳蜗鼓阶内的电极直接刺激听神经来重建聋人的听觉功能,全世界已有超过300000患者因此获益。但它是一种侵入性的手术治疗,在噪声环境下的言语识别率还有待进一步提高。助听器和电子耳蜗只能作为补偿手段改善患者听力,不能从根本上重建受损的听觉生理功能,逆转患者的听力水平。近年来生物治疗方法在内耳细胞保护、修复和再生方面展现出了巨大的潜能,主要有干细胞移植、基因治疗以及生长因子治疗等。骨髓间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells, MSCs)是骨髓中除了造血干细胞以外的另一类具有多系分化潜能、强大自我复制能力和可移植性的成体干细胞。在适宜的微环境下,MSCs可以定向诱导分化为多种组织和细胞类型,如成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞,还可跨胚层分化为神经细胞、心肌细胞、血管内皮细胞、肝细胞等。由于MSCs来源广泛、容易分离培养、免疫原性低等特点,被广泛应用于细胞移植及基因治疗中。生长因子是一种促进特定细胞生长的细胞因子,能和细胞膜表面的特异性受体结合从而激活细胞内信号通路发挥作用,它们对多种器官的不同类型细胞的存活、增殖、分化都有调控作用。在内耳发育成熟过程中可检测到胰岛素样生长因子1(Insulin-like Growth Factor1, IGF1)、表皮生长因子(Epidermal Growth Factor,EGF)和成纤维细胞生长因子2(Fibroblast Growth Factor2, FGF2)三种生长因子及其受体的表达,这些生长因子可保护内耳毛细胞免受损害并促进内耳毛细胞的增殖分化。在感音神经性耳聋生物治疗中,诱导干细胞向内耳毛细胞样细胞分化的研究常采用干细胞与一些特定组织细胞共培养以及添加外源性生长因子的方法。为了将两种方法结合用于研究,本文设计了一种可同时表达三种活化型生长因子的慢病毒载体并用于构建稳定转染的细胞,试图为干细胞移植结合生长因子治疗感音神经性耳聋提供基础。 1、建立表达三种活化型生长因子的细胞系活化型EGF编码序列采用RT-PCR方法从SW620人大肠癌细胞中克隆,活化型IGF1和FGF2编码序列为人工合成。用PCR的方法分别从pSecTag2A和pIRES2-EGFP质粒中克隆出引导分泌的免疫球蛋白Igκ链信号肽编码序列和引导翻译的内部核糖体进入位点(Internal Ribosome Entry Site, IRES)序列。将Igκ链信号肽和三种因子的编码序列分别融合、由IRES间隔并克隆到带绿荧光蛋白报告基因的慢病毒表达质粒pLVX-IRES-ZsGreenl上并包装获得慢病毒。将慢病毒感染HEK293T细胞,通过有限稀释法筛选出稳定表达绿荧光蛋白的单细胞克隆,命名为HEK293T/3GF.用Western blot检测单细胞克隆的IGF1、EGF和FGF2的表达,并通过促进肺癌A549细胞生长实验验证分泌的生长因子的活性。 2、共培养诱导骨髓间充质干细胞向内耳毛细胞样细胞分化利用构建成功的可同时表达三种活化型生长因子的HEK293T/3GF细胞与MSCs进行共培养,探索其在内耳诱导分化中的作用。采用全骨髓贴壁筛选法分离提取大鼠MSCs,体外培养纯化扩增到第四代后,与表达活化型生长因子的HEK293T/3GF细胞及未转染的HEK293T细胞进行共培养,并添加维甲酸(Retinoic Acid, RA),共培养21天后,显微镜下观察MSCs;形态变化,RT-PCR;检测毛细胞相关标记表达情况。HEK293T/3GF与MSCs共培养组与对照组相比,显微镜下可观察到细胞形态向神经细胞样改变,而且RT-PCR结果显示,HEK293T/3GF与MSCs共培养后MSCs表达毛细胞相关标记,说明HEK293T/3GF与MSCs共培养可以诱导MSCs向内耳毛细胞样细胞分化。结论：本课题成功构建了可同时表达活化型IGF1、EGF和FGF2的慢病毒载体,并获得稳定表达三种因子的HEK293T/3GF细胞,该细胞与MSCs共培养显示出诱导分化作用,为进一步的内耳细胞治疗提供了新的方法。
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【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R764.431

【参考文献】