线粒体功能障碍在遗传性视神经病变发病中的作用

发布时间：2021-03-06 08:38

Leber遗传性视神经病变(LHON)和常染色体显性视神经萎缩(ADOA)是最常见的两种遗传性视神经病变,常为青少年发生视力损伤。LHON和ADOA均与线粒体功能障碍有关。LHON是由于mtDNA原发突变导致呼吸链复合体功能障碍所致；OPA1基因是ADOA的主要致病基因,它编码一种影响线粒体形态及mtDNA稳定性的动力相关GTP酶。此外,其他修饰因子(线粒体单体型,mtDNA继发突变和核基因)影响遗传性视神经病变的外显率和表现度。第一部分：m.14484TC(MT-ND6)是LHON相关的原发突变,但突变本身尚不足以导致LHON的发生,线粒体单体型和mtDNA继发突变可能与携带m.14484TC突变家系的外显率和表现度有关。本研究对41个携带m.14484TC突变的中国汉族LHON家系进行临床、遗传和线粒体基因组分析。结果表明单体型M9,M10和N9是中国汉族LHON人群的易感因素,而单体型特异位点m.3394TC (MT-ND1), m.14502TC(MT-ND4)和m.14693AG(MT-TE)可能协同m.14484TC增加中国汉族LHON家系的外显率和表现度。第二部分：本章节对LHON相关的MT-ND1 m.3635GA突变的分子致病机制进行研究。我们对1,070个中国汉族LHON家系的MT-NDl基因进行突变筛查,发现9个携带m.3635GA突变的LHON家系,呈典型的母系遗传。建立转线粒体细胞系,并对其进行生化功能分析。结果显示,m.3635GA突变导致呼吸链复合体Ⅰ活力下降,线粒体ATP合成和Aψm显著降低,ROS产生增加,可能影响能量需求较高的视网膜神经节细胞(RGCs),导致视力下降。第三部分：我们发现一个携带OPA1 C.1198CG (p.P400A)杂合突变的中国汉族ADOA家系。建立细胞模型,并进行生化功能研究,阐明p.P400A突变导致ADOA的分子致病机制。结果表明,p.P400A导致OPA1表达量下降,线粒体形态异常,mtDNA拷贝数减少,线粒体翻译和呼吸功能障碍,细胞凋亡和自噬增加,从而使得能量需求较高的RGCs发生退行性变,导致ADOA的发生。我们的研究结果将为遗传性视神经病变的诊断、治疗、预防、干预和遗传咨询提供理论依据。
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R774.6

文章目录

致谢

摘要

Abstract

中英文缩略词表

第1章绪论

1 视神经萎缩

2 视网膜神经节细胞和视神经的易感性

2.1 解剖结构

2.2 生理特性

3 线粒体

3.1 线粒体的起源

3.2 线粒体的形态和结构

3.3 线粒体基因组

3.4 异质性和阈值效应

3.5 线粒体单体型

3.6 线粒体与氧化磷酸化

3.7 核基因和线粒体基因的相互作用

4 Leber遗传性视神经病变

4.1 概述

4.2 mtDNA突变与LHON

4.3 mtDNA单体型与LHON

4.4 核修饰基因在LHON发病中的作用

4.5 动物模型

4.6 LHON发病的分子机制

5 常染色体显性视神经萎缩

5.1 常染色体显性视神经萎缩

5.2 OPA1基因

5.3 动物模型

6 治疗策略

6.1 支持疗法

6.2 神经营养疗法

6.3 基因治疗

7 遗传咨询

8 展望

第2章材料方法

1 研究对象

2 研究内容

3 实验仪器

4 实验方法

4.1 永生淋巴细胞系的建立

4.2 胞质杂合体的构建

4.3 突变位点的鉴定

4.4 细胞计数

4.5 mtDNA拷贝数检测

4.6 氧消耗速率的测定

4.7 ATP检测

4.8 ROS检测

4.9 线粒体膜电位测定

4.10 Annexin V-FITC/PI双染法检测早期细胞凋亡

4.11 蛋白质免疫印迹

4.12 线粒体的提取

4.13 酶活力测定

4.14 RNA提取方法（Trizol法）

4.15 实例荧光定量PCR（QRT-PCR）

4.16 透射电镜样品的制备

4.17 生物信息学分析

第3章线粒体单体型影响携带m.14484T>C（MT-ND6）中国Leber遗传性视神经病变家系的表型表达

1 研究背景

1.1 MT-ND6基因与LHON

1.2 线粒体单体型和LHON

2 材料方法

3 研究结果

3.1 中国LHON家系m.14484T>C（MT-ND6）突变筛查

3.2 27个携带m.14484T>C家系的临床和遗传学评估

3.3 线粒体基因组分析

3.4 携带m.14484T>C突变mtDNAs的系统进化树和单体型分析

3.5 统计学分析

4 讨论

5 结论

第4章 Leber遗传性视神经病变相关的MT-ND1 m.3635G>A突变的功能研究

1 研究背景

2 材料方法

3 研究结果

3.1 9个中国LHON家系的遗传和临床评估

3.2 mtDNA分析

3.3 胞质杂合体的构建

3.4 呼吸链复合体Ⅰ酶活力降低

3.5 ATP产量显著下降

3.6 线粒体膜电位降低

3.7 ROS产生增加

4 讨论

5 结论

第5章 OPA1基因p.P400A突变在常染色体显性视神经萎缩发病中的作用

1 研究背景

1.1 临床评估

1.2. 分子生物学评估

2 材料方法

3 研究结果

3.1 细胞膜型的构建与鉴定

3.2 OPA1基因表达水平检测

3.3 线粒体形态改变

3.4 mtDNA拷贝数减少

3.5 线粒体蛋白表达量下降

3.6 呼吸链复合体酶Ⅳ活力下降

3.7 呼吸功能缺陷

3.8 线粒体ATP产生减少

3.9 线粒体膜电位改变

3.10 ROS产生增加

3.11 细胞凋亡增加

3.12 自噬水平增加

4 讨论

5 结论

第6章论文创新性

第7章存在的问题与展望

参考文献

附录1 27个携带m.14484T>C突变家系mtDNA变异

附录2 9个携带m.3635G>A突变先证者和1个对照（A40）mtDNA变异

附录3 知情同意书

附录4 LHON知识手册

附录5 视神经萎缩病例调查表

附录6 基因检测报告

作者简历

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