【摘要】：糖尿病(diabetes mellitus,DM)为临床上比较常见的内分泌代谢性疾病,是世界范围内发病率和死亡率较高的五大疾病之一。伴随当代经济快速发展以及生活水平的提高,DM的发生率正在呈快速上升趋势,预计2025年将增长至3.5亿人。糖尿病视网膜病变(Diabetic retinopathy,DR)是DM最常见的并发症之一,已经成为DM患者视力减弱乃至失明的重要原因,严重影响患者生活质量。因此深入探索DR的发病机制,为临床寻找新的方法治疗DR具有重大意义。有文献报道,链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病大鼠视网膜中出现大量空泡样变,视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs)胞体肿胀,数目显著减少,并发生明显凋亡。同时越来越多的研究证实,在DM早期出现视网膜神经节细胞病变,并伴随RGCs损伤、凋亡、结构改变及功能状态减退。众所周知,RGCs是唯一的视觉输出细胞,且RGCs轴突是视神经的重要组成部分,因此RGCs受损、凋亡及再生修复是DR发病及视力减退的重要机制之一。尽管国内外目前对糖尿病RGCs已经展开了大量研究,但RGCs损伤、凋亡、再生受抑的原因及具体分子机制并未完全明确,仍需进一步探索。近年研究发现,轴突生长抑制因子蛋白受体(Nogo receptor,Ng R)在视神经节细胞的损伤、修复及再生中发挥关键作用。将其干扰后能有效恢复大鼠RGCs细胞活力,促进细胞增殖,抑制细胞凋亡。本课题组前期工作表明,DR病理条件下,视网膜组织中Ng R及Rock1蛋白表达明均显上调,提示Ng R-Rho A-Rock1信号通路在DR状态下被激活。此外,Rho A/Rock信号通路激活后作用于细胞骨架蛋白(F-actin),进而抑制轴突末端生长锥的延伸及神经节再生。而将该信号上游蛋白Ng R抑制后可以恢复视网膜受损后的轴突再生功能,抑制RGCs凋亡。表明Ng R-Rho ARock1信号通路亦很可能参与调控糖尿病视网膜神经节细胞受损、凋亡及再生过程。睫状神经营养因子(ciliary neurotrophic factor,CNTF)是一种多效神经营养因子,可以滋养神经节细胞并促进轴突生长。视网膜局部神经营养因子缺乏难以维持RGCs生存,是导致DR患者视力下降的又一重要因素。有研究证实CNTF对外伤性视神经损伤RGCs具有明显保护作用,而外源性给予CNTF可明显保护遗传性糖尿病小鼠及Ⅰ型糖尿病大鼠的视力。提示,CNTF在视神经修复、轴突再生及神经节细胞凋亡中扮演重要角色,但其对糖尿病视网膜神经节细胞的影响及调控机制目前国内外仍知之甚少。综上,本课题拟通过体内、外实验研究si Ng R及CNTF对糖尿病视网膜神经节细胞生存及再生的影响,并探讨两者是否存在协同作用以及相关分子调控机制。期望能为DR临床治疗提供可靠的实验依据以及新型治疗方案。第一部分Ng R干扰及CNTF预处理对高糖诱导的RGC-5凋亡的影响目的:明确si Ng R及CNTF对高糖诱导的大鼠RGC-5增殖、损伤及凋亡的影响。方法:RGC-5转染si Ng R或给予CNTF预处理,高糖诱导建立细胞损伤模型。实验设置对照组、高糖组、高糖+NC组、高糖+si Ng R组、高糖+CNTF组、高糖+CNTF+si Ng R组。细胞培养48 h后,采用MTT实验检测细胞增殖变化,流式细胞术分析细胞凋亡情况,Real-time PCR及Western blot检测Ng R及其下游Rho A、Rock1 m RNA和蛋白的表达,免疫荧光技术对RGCs特异性标志物及突起长度进行定量分析。结果:MTT及流式细胞术检测结果显示,高糖导致RGC-5细胞增殖能力显著降低,凋亡数量明显增加(P0.01),而si Ng R转染或CNTF预处理后RGC-5细胞的增殖能力显著提高,凋亡数量明显减少(P0.01),且si Ng R与CNTF存在协同作用;Real-time PCR及Western blot检测结果显示,Ng R、Rho A及Rock1 m RNA及蛋白在细胞模型中的表达显著增加(P0.01),而si Ng R转染或CNTF预处理后三者表达水平均显著下降(P0.01),且si Ng R与CNTF存在协同作用;免疫荧光检测结果显示,经高糖诱导后RGCs细胞突起变短,标志物表达水平显著下降(P0.01),而si Ng R转染或CNTF可以提高标志物的表达,增加细胞突起长度,且si Ng R与CNTF存在协同作用。结论:Ng R干扰或外源性给予CNTF可以协同保护RGC-5,促进受损细胞存活,抑制细胞凋亡,且同Ng R-Rho A-Rock1信号通路密切相关。第二部分si Ng R及CNTF对糖尿病大鼠RGCs凋亡及再生的影响目的:明确玻璃体内注射si Ng R或CNTF对糖尿病大鼠RGCs凋亡及再生的影响。方法:腹腔注射STZ建立糖尿病大鼠模型,成功诱导后玻璃体内局部注射si Ng R或CNTF进行干预,实验设置对照组、糖尿病组、糖尿病+NC组、糖尿病+si Ng R组、糖尿病+CNTF组,糖尿病+CNTF+si Ng R组。12周后取各组大鼠视网膜组织,采用HE染色观察神经节细胞数量及形态,TUNEL法分析RGCs凋亡率,Western blot检测细胞凋亡及轴突再生相关蛋白的表达,Real-time PCR及免疫组化技术进一步验证轴突再生标志物m RNA及蛋白表达水平变化。结果:HE染色及TUNEL检测结果显示,糖尿病大鼠RGCs层空泡化,数量明显减少,凋亡率显著上升(P0.01),而玻璃体内注射si Ng R或CNTF后RGCs数量明显增加,凋亡率显著下降(P0.01),且si Ng R与CNTF存在协同作用。Western blot检测结果显示,糖尿病大鼠视网膜组织中Bax、caspase-3的表达显著增加,Bcl-2及F-actin、GAP-43的表达明显减少(P0.01),而玻璃体内注射si Ng R或CNTF可以明显逆转上述指标的表达,且si Ng R与CNTF存在协同作用;Real-time PCR及免疫组化实验进一步证实了si Ng R或CNTF可以显著增加轴突再生标志物Factin、GAP-43 m RNA及蛋白的表达。结论:si Ng R和CNTF可以协同促进糖尿病大鼠RGCs存活,诱导轴突再生,抑制细胞凋亡。第三部分si Ng R及CNTF影响糖尿病RGCs凋亡及再生的分子机制目的:明确si Ng R或CNTF对糖尿病大鼠RGCs的影响是否同Ng RRho A-Rock1信号通路有关。方法:腹腔注射STZ建立糖尿病大鼠模型,药物治疗及实验分组同第二章。16周后收集各组大鼠视网膜组织,采用Real-time PCR及Western blot技术检测Ng R、Rho A、Rock1 m RNA及蛋白的表达。结果:Real-time PCR及Western blot检测结果显示,糖尿病大鼠视网膜组织中Ng R、Rho A、Rock1 m RNA及蛋白的表达显著增加(P0.01),而玻璃体内注射si Ng R或CNTF后三个指标的表达水平均显著下降(P0.01),且si Ng R与CNTF存在协同作用。结论:si Ng R和CNTF可以协同抑制Ng R-Rho A-Rock1信号通路激活,诱导RGCs再生,抑制细胞凋亡。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R774.1;R587.2
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本文编号：
2289384
