【摘要】：第一部分D-半乳糖诱导的听皮层拟老化大鼠模型的建立 目的：D-半乳糖诱导的Sprague-Dawley (SD)大鼠听皮层拟老化模型的建立。方法：2个月龄SD雄性大鼠162只,随机分为对照组和拟老化组：其中拟老化组大鼠给予颈背部皮下注射500mg/kg/d的D-半乳糖,连续8周；对照组大鼠颈背部皮下注射等体积生理盐水,连续8周。造模结束后,拟老化组和对照组各分为三个年龄亚组：4个月龄组(即造模完成后0个月)、10个月龄组(即造模完成后6个月)和16个月组(即造模完成后12个月)。每个亚组27只SD大鼠。完成造模后,检测每只大鼠听性脑干反应(Auditory Brainstem Response, ABR);酶标仪比色法检测总超氧化歧化酶(Total Superoxide Dismutase, T-SOD)的变化以及还原型谷胱甘肽与氧化型谷胱甘肽比值(Glutathione:Oxidant glutathione,GGSH:GSSG)的变化；高效液相色谱分析法和酶标仪比色法检测丙二醛(Malondialdehyde, MDA)浓度的变化；实时定量PCR检测听皮层线粒体DNA (Mitochondrial DNA,mtDNA)常见缺失(Commen Deletion,CD)的变化；通过甲苯胺蓝染色来检测听皮层组织细胞数量变化；通过透射电镜(Transmission electron microscopy, TEM)来检测大鼠听皮层组织细胞超微结构的变化；通过原位末端标记法(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase (TdT)-mediated Deoxyuridine Triphosphate (dUTP) Nick-End-Labelling TUNEL)来观察神经元细胞凋亡情况。 结果：ABR结果示在4月龄,10月龄,16月龄时,相同频率(4kHz、8kHz、16kHz,24kHz、32kHz)拟老化组和对照组比较,阈值变化不具备统计学差异(P0.05);比色法结果示：与对照组相比,10月龄与16月龄拟老化组大鼠听皮层SOD活性降低(P0.01),GSH:GSSG比值降低(P0.05)；比色法与高效液相色谱法显示,拟老化组MDA浓度明显增加(P0.05)；甲苯胺蓝染色示,拟老化组大鼠听皮层组织神经元与同月龄对照组相比数量降低,16月龄时,变化具有统计学差异(P0.05)；电镜检测结果显示,同月龄的拟老化组与对照组大鼠相比神经纤维脱髓鞘样变、线粒体肿胀、脂褐素沉积、染色质固缩、细胞核变形等细胞超微结构退行性变更为明显且出现时间更早；TUNE染色结果显示,拟老化组大鼠听皮层细胞凋亡数目与同月龄的对照组大鼠相比,10月龄和16月龄细胞凋亡数目增加,差异具有统计学意义(P0.01)。 结论：高剂量D-半乳糖导致听皮层抗氧化酶活性降低、氧化应激增加、mtDNACD蓄积、神经元细胞超微结构退行性变明显、神经元密度下降、凋亡数目增多,促进了大鼠听皮层组织的衰老过程。 第二部分探讨线粒体抗氧化酶Trx2在D-半乳糖诱导的听皮层早衰中的作用 目的：我国社会老龄化趋势日益明显,在困扰老年人健康的慢性疾病中,老年性聋已跻身于第三位,仅次于高血压与关节炎。老年性聋是影响老年人生活质量的主要疾病之一,有研究表明老年性聋与氧化应激密切相关,然而老年性聋的具体发病机制尚不明确。硫氧还蛋白2(Thioredoxin2,Trx2)是特异位于线粒体的小分子蛋白,它在抗氧化应激、阻止线粒体介导的细胞凋亡等方面发挥着不可忽略的作用。本项研究意在探讨Trx2在D-半乳糖诱导的听皮层拟老化中的可能的作用机制。 方法：2个月龄SD雄性大鼠114随机分为对照组和拟老化组：其中拟老化组大鼠给予颈背部皮下注射500mg/kg/d的D-半乳糖,连续8周；对照组大鼠颈背部皮下注射等体积生理盐水,连续8周。造模结束后,拟老化组和对照组各分为三个年龄亚组：4个月龄组(即造模完成后0个月)、10个月龄组(即造模完成后6个月)和16个月组(即造模完成后12个月)。RT-PCR检测硫氧还蛋白2(Thiredoxin2,Trx2),硫氧还蛋白结合蛋白(Thioredoxin-Interacting Protein,TXNIP)和凋亡信号调节激酶1(Apoptosis Signal Regulating Kinase1, ASK1) mRNA表达;western blot检测Trx2,TXNIP和ASK1蛋白表达；western blot检测ASK1活性变化；免疫共沉淀检测Trx2-TXNIP及Trx2-ASK1复合体的变化；免疫荧光技术检测Trx2和ASK1在听皮层组织的表达及定位；免疫组织化学技术检测TXNIP在听皮层组织的表达及定位。 结果：RT-PCR结果显示：与对照组相比,拟老化组大鼠Trx2mRNA水平在4月龄,10月龄和16月龄分别下降了1.16-,1.40-(P0.01),和1.45-倍(P0.01),TXNIP mRNA水平分别上升了1.39-(P0.05),1.40-(P0.01),和1.50-倍(P0.05),ASK1mRNA水平分别上升了1.18-,1.25-(P0.01),和1.26-倍(P0.01)；在对照组,16月龄大鼠与4月龄大鼠相比,Trx2mRNA水平降低了1.29倍(P0.05),而TXNIP与ASK1mRNA水平分别升高了1.59-(P0.05)和1.12-倍。在拟老化组,16月龄大鼠与4月龄大鼠相比,Trx2mRNA水平降低了1.29倍(P0.05),而TXNIP与ASK1mRNA水平分别升高了1.71倍(P0.01)和1.42倍。Western blot结果显示：与对照组相比,拟老化组大鼠在4月龄,10月龄和16月龄中Trx2水平分别降低1.50-,1.61-(P0.05)和1.56-倍(P0.05),TXNIP水平分别上升了1.34-(P0.05),1.44-(P0.05),和1.57-倍(P0.05),ASK1水平分别上升了1.15-,2.19-(P0.01)和2.17-倍(P0.01)；我们的western blot结果还显示,在对照组和拟老化组,Trx2蛋白随着年龄的增长而降低,而TXNIP和ASK1蛋白水平随年龄的增长而升高。在对照组中,16月龄与4月龄相比,Trx2蛋白下降1.54倍,TXNIP蛋白上升1.42倍(P0.05), ASK1蛋白上升1.59倍。在拟老化组中,16月龄与4月龄相比,Trx2蛋白下降1.77倍(P0.01)倍,TXNIP蛋白上升2.30-倍(P0.01), ASK1蛋白上升1.75-倍(P0.05)。此外,ASK1活性在拟老化组明显增加,并且随着年龄的增长而增加(P0.01)。免疫沉淀结果显示：[rx2-TXNIP和Trx2-ASK1复合体仅存在于线粒体,并且与对照组相比,4月龄,10月龄和16月龄拟老化组Trx2-TXNIP复合体分别增加了1.63-(P0.05),1.21-(P0.05)和1.26-倍(P0.01),而Trx2-ASK1复合体分别降低了1.09-(P0.05),1.48-(P0.01)和1.37-倍(P0.05)。与此同时,我们还发现,Trx2-TXNIP复合体随年龄的增加而增多,但Trx2-ASK1复合体随年龄的增加而减少。在对照组,16月龄大鼠与4月龄大鼠相比,Trx2-TXNIP复合体增加了2.38倍(P0.01)而Trx2-ASK1复合体降低了2.61倍(P0.01)。在拟老化组,16月龄大鼠与4月龄大鼠相比,Trx2-TXNIP复合体增加了2.99倍(P0.01)而Trx2-ASK1复合体降低了2.01(P0.01)倍。 结论：听皮层Trx2的下降和TXNIP-Trx2-ASK1信号通路的改变导致听皮层抵抗氧化应激能力下降,进而导致ROS生成增加,神经元超微结构的改变以及氧化应激累积,线粒体功能障碍和异常增多的细胞凋亡。这些变化促使老年性聋的出现。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R764.43
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本文编号：
2292071
