【摘要】：第一部分HMGA2在鼻咽癌中的表达及临床意义目的：比较HMGA2在鼻咽癌组织及鼻咽慢性炎组织中的差异,分析HMGA2与临床病理因素及预后的关系。方法：1.采用实时荧光定量PCR法检测72例鼻咽癌及20例鼻咽慢性炎石蜡标本组织中HMGA2 mRNA表达,分析其与临床病理因素的关系。2.采用免疫组化法检测124例鼻咽癌及20例鼻咽慢性炎石蜡标本组织中HMGA2表达情况,并分析其与临床病理因素的关系。3.采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线,比较HMGA2 mRNA低表达组及高表达组3年无病生存率的差异。4.采用Log-rank检验比较124例患者免疫组化检测HMGA2蛋白低表达组与高表达组3年总生存率的差异。风险比例模型(Cox回归)分析影响预后的不良因素。结果：1.72例鼻咽癌组织中HMGA2 mRNA相对表达量(中位数0.294)高于鼻咽慢性炎组织(中位数0.045),差异有统计学意义(P0.05)。HMGA2 mRNA在鼻咽癌组织中的表达与年龄、性别、分型、分期、复发参数无关(P0.05),与鼻咽癌患者的2年内转移有关(P0.01)。2.124例鼻咽癌标本中59例HMGA2蛋白高表达(阳性率：47.58%),20例鼻咽慢性炎HMGA2均无表达(阳性率：0),鼻咽癌组织中HMGA2表达阳性率显著高于慢性炎组织(x2=16.12,P0.01)。124例患者HMGA2蛋白在鼻咽癌中的表达与患者N分期、TNM分期、2年内复发、转移因素有关(P0.01)。3.定量PCR结果显示在生存率方面,HMGA2 mRNA高表达组的3年无病生存率相对较低(HR:3.52; 95% CI:1.34-7.79; P=0.01)。4.免疫组化显示,全组鼻咽癌患者的3年生存率为78.8%(95%CI:0.708-0.852), HMGA2蛋白低表达组及高表达组3年生存率分别为90.8%(95%CI：0.806-0.957)及66.1%(95%CI：0.525-0.766),差异有统计学意义(P0.001)。单因素分析得出T分期、N分期,TNM分期及HMGA2高表达为不良预后因素。多因素分析得到N分期(HR：7.892,95%CI：2.731-22.807,P0.001)和HMGA2高表达((HR：2.683,95%CI：1.185-6.077,P=0.018))为影响鼻咽癌患者生存率的独立的不良预后因素。结论：HMGA2与鼻咽癌的发生、发展有相关性,其有可能用于鼻咽癌的预后监测及作为鼻咽癌治疗的靶分子。第二部分HMGA2的表达对鼻咽癌细胞恶性生物学行为的影响目的：体外实验初步明确HMGA2对鼻咽癌增殖、生长、侵袭、转移等恶性生物学行为的影响。方法：1.采用实时荧光定量PCR法检测及Western blot法检测人永生化鼻咽上皮细胞NP-69细胞株,人鼻咽癌细胞株CNE-1, CNE-2,5-8F,6-10B, C666-1, HNE-1中HMGA2 mR NA及蛋白的表达情况。2.选取相对高表达HMGA2的两株细胞CNE-1、CNE-2,瞬时转染si-HMGA2, CCK-8及平板克隆形成实验观察细胞增殖,[ranswell小室法检测细胞迁移、侵袭能力,流式细胞仪观察细胞周期的变化。结果：1.鼻咽癌各细胞株中HMGA2 mRNA的表达均显著高于NP69(P0.01)。同样,HMGA2蛋白在鼻咽癌肿瘤细胞中也呈高表达,在正常鼻咽上皮细胞表达较低,结果有统计学差异(P0.01)。2.敲低HMGA2表达可以抑制鼻咽癌细胞的增殖能力,转染si-HMGA2后,CNE-1和CNE-2细胞的生长速度在第2天、第3天、第4天均低于阴性对照组与空白组,差异具有统计学意义(P0.001)。细胞迁移实验表明,CNE-1与CNE-2两株细胞的si-HMGA2组的细胞迁移的个数为41.22±4.45个及45.34±6.11个,对照组迁移的细胞数量为141.344±5.22及157.36±6.41,两组比较均有统计学差异(P0.001)。侵袭实验显示,CNE-1、CNE-2细胞中si-HMGA2组穿过Matrigel胶的细胞数分别为34.03±4.56,41.48±5.31,对照组细胞数分别为113.83±4.18及135.33±4.36,两株细胞中两组比较均有统计学差异(P0.001)。克隆形成实验显示,干扰HMGA2组与对照组相比CNE-1、CNE-2两株细胞的克隆形成率分别降低了45%,55%(P0.001)。流式细胞仪结果显示,si-HMGA2组与对照组相比,G1期细胞比例增高(P0.001), G2/M期细胞比例减少(P0.001)。结论：体外实验证实了HMGA2可能参与了鼻咽癌的一系列恶性生物学行为,包括肿瘤发生、增殖、侵袭、转移等。第三部分HMGA2诱导E MT对鼻咽癌恶性生物学行为影响的机制目的：检测并分析鼻咽癌HMGA2与上皮间质转化标记物表达的相关性,初步探讨HMGA2促进EMT可能的分子机制。方法：1.免疫组化法检测124例鼻咽癌石蜡样本中E-cadherin、Vimentin在癌组织中的表达。分析E-cadherin、Vimentin蛋白的表达与鼻咽癌临床病理因素及预后关系。2. Spearman等级秩相关分析HMGA2、E-cadherin、Vimentin两两表达之间的相关关系。3. Western blot及细胞免疫荧光实验观察CNE-1、CNE-2细胞株中干扰HMGA2表达后E-cadherin、Vimentin、Snail在鼻咽癌细胞中的表达变化。4.干扰HMGA2的表达后,Western blot法观察TGF-β/Smad通路中关键蛋白的变化。结果：1. HMGA2表达见第一部分,E-cadherin阳性颗粒主要定位于细胞膜,Vimentin阳性颗粒定位于细胞浆和／或部分细胞膜。E-cadherin在20例鼻咽慢性炎组织中15例高表达(阳性率：75%),在鼻咽癌组织中54例高表达(阳性率：43.55%),结果提示鼻咽癌组织中E-cadherin表达率低于慢性炎组织(x2=6.826,P0.001); Vimen tin在20例鼻咽慢性炎组织中均阴性表达(阳性率：0),鼻咽癌组织中78例高表达(阳性率：62.9%),提示鼻咽癌组织中Vimentin阳性表达率高于慢性炎组织(x2=27.449, P0.001)。2. E-cadherin在鼻咽癌中的表达与患者N分期、TNM分期、2年内复发及转移有关(P0.01)。 Vimentin在鼻咽癌中的表达与患者N分期、TNM分期、2年内复发及转移有关(P0.01)。在低表达E-cadherin组3年总生存率为70%(95%CI：0.578-0.792),而高表达E-cadherin组3年总生存率为88.8%(95%CI：0.768-0.948)；低表达Vimentin组3年总生存率为89.1%(95%CI：0.757-0.953),而高表达Vimentin组3年总生存率为71.8%(95%CI：0.604-0.804),差异均有统计学意义(P0.001)。3. E-cadherin与Vimentin表达呈负相关((r=-0.605,P0.001)。HMGA2的表达水平与Vimentin呈正相关(r=0.431,P0.001),HMGA2与E-cadherin表达水平呈负相关(r=-0.413,P0.001)。4. Western blot结果显示在HMGA2高表达细胞株CNE-1、CNE-2中,E-cadherin表达较低,Vimentin表达较高,干扰HMGA2后,E-cadherin的表达均较对照组上调,Vimentin与Snail的表达均较对照组下调。细胞免疫荧光观察CNE-2、CNE-1,干扰HMGA2组绿色荧光标记的E-cadherin(定位于胞膜)表达上调,红色荧光标记Vimentin组(定位于胞浆或胞膜)表达下调。5.在细胞株CNE-1、CNE-2中,观察TGFβRⅡ、Smad3、p-Smad3的表达情况,干扰HMGA2的表达后,发现TGFβ/Smad通路的关键蛋白TGFβRⅡ、 p-Smad3均显著下调。结论：HMGA2的表达与EMT的上皮标志物E-cadherin表达呈负相关,与间质标志物Vimentin表达呈正相关。干扰HMGA2可导致E-cadherin上调、Vimentin下调,并可能通过TGF-β/Smad信号通路参与鼻咽癌EMT过程从而影响鼻咽癌增殖、转移等恶性生物学行为。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R739.63
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本文编号：2300271
