SirT1及STAT3保护视网膜色素上皮细胞抗氧化应激作用的实验研究

发布时间：2018-12-10 10:57

【摘要】：目的：年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration, AMD)是西方工业国家中引起中央视野缺以至于致盲最常见的病因,我国由于人口老龄化,发病率也有上升。对AMD发病机制的研究将有助于AMD的防治提供思路。研究表明氧化应激能造成细胞功能紊乱及功能缺损。因此本研究旨在揭示氧化应激状态下视网膜色素上皮细胞(retinal pigmented epithelium cells, RPE) SirTl和STAT3之间的相互作用,并探讨其在早期AMD发病机制中的意义。方法：1)人视网膜色素上皮细胞氧化应激损伤模型的建立及氧化应激对RPE损伤的评估。体外培养人ARPE-19细胞系,ox-LDL (200 μg/ml)及H2O2 (50μM)干预培养细胞诱导氧化应激,采用膜联蛋白V/碘化丙啶(annexin V-fluorescein isothiocyanate and propidium iodide, AVFI/PI)对细胞增殖和凋亡率进行分析,乙酰乙酸钠(DCFH-DA)荧光探针检测细胞内生活性氧(ROS)水平,采用SA-β-gal方法分析评估H202及ox-LDL诱导的RPE细胞衰老水平,从而详细了解及评估氧化应激对RPE的损伤；2)上一步研究的基础上,对氧化应激过程中SirT1mRNA表达进行分析研究。H202干预后Real-Time荧光定量PCR(qRT-PCR)对RPE细胞SIRT1 mRNA表达变化进行分析；3) SirT1保护RPE抗氧化应激损伤。采用SirT1激动剂白藜芦醇(RSV)及抑制剂烟酰胺(NA)分别预处理RPE细胞,经H2O2 (50 μM)及ox-LDL (200 Rg/ml)干预后通过对增殖、凋亡、ROS及细胞衰老状态的分析,使用靶向siRNA对SIRT1进行敲除,作为阴性对照,从而深入了解SIRT1抗RPE氧化应激效果；4)通过gain and loss功能研究深入分析SirTl/STAT3相互作用对暴露于氧化应激状况下RPE细胞的影响。Western Blot法检测在敲除或上调SIRT1表达后STAT3基因表达及蛋白表达的影响。结果：1氧化应激能造成RPE损伤,并导致SirT1和STAT3功能紊乱为模拟AMD病程中的氧化损伤,H202和ox-LDL作为外源性氧化剂诱导RPE的病理性应激。H202和ox-LDL分别干预RPE细胞24后,分析细胞的增殖、凋亡和内生活性氧及ARPE-19细胞的衰老状况。研究表明H202和ox-LDL干预后,细胞的增值率显著下降而凋亡率显著升高、ROS水平显著升高并促使细胞衰老增加。为评价SirT1与STAT3在氧化应激中的作用,我们对SirT1和STAT3在RPE中的表达进行分析。我们发现与对照组相比,H2O2和ox-LDL干预RPE之后SirT1 mRNA表达量显著下调,与之相反的是,STATS mRNA表达量是显著上升的。这些结果证明氧化应激诱导RPE损伤并造成SirT1和STAT3 mRNA表达失调。2. SirT1保护RPE抗氧化应激损伤RPE分别用SirT1抑制剂NA、SirT1激活剂RSV预处理,随后用H2O2(50μM)和ox-LDL (200 μg/ml)干预24小时。最终进行ARPE-19细胞的增殖、凋亡细胞内ROS和RPE衰老分析。结果提示,NA提高H2O2的毒性作用,显著减低增值率,刺激凋亡,使ROS累积和衰老增加。同NA的作用相比SirT1激活剂RSV,表现出显著的抗H2O2毒性作用。而ox-LDL诱导RPE存在相似的研究结论作。氧化应激过程中,SirT1能负向调节STAT3的表达本研究探讨了SirT1与STAT3活化之间的相关性,通过观察SirT1基因敲除后STAT3的表达差异,及氧化应激过程中STAT3的过表达分析,深入研究SirT1在RPE氧化应激过程中的防护作用.SirT1激活剂白藜芦醇RSV显著降低STAT3表达量,但当SirT1基因敲除之后,我们发现同H2O2干预组与对照组相比,RPE的STAT3表达量显著上升。更进一步地,我们发现SirT1基因敲除能提高氧化应激过程中STAT3蛋白和磷酸化STAT3蛋白表达；而缺乏氧化应激的刺激剂RSV与SirT1基因敲除并不能影响STAT3的表达。反之我们也分析了STAT3基因敲除状态下RPE的SirT1表达及氧化应激状态下的SirT1表达。通过Western blot分析检测每组STAT3蛋白表达。氧化应激状态下,同C-STAT3OV相比,STAT3过表达能显著导致SirT1表达下降。而STAT3KO组SirT1表达量显著增加。这些结果表明氧化应激状态下STATS对RPE的SirT1表达产生负向调节作用。STATS能保护ARPE-19细胞抗氧化应激损伤,独立调节细胞衰老为深入了解氧化应激状态下STAT3及SirT1对RPE细胞的防护效果的相关性,因此我们研究了SirT1抑制剂NA预处理RPE后STAT3抗氧化效果. STAT3增强NA组细胞增殖能力,减少细胞凋亡,并导致内生ROS增加。然而, STAT3并不能影响细胞衰老。上述结果表明STAT3具有直接的保护细胞抗氧化应激作用,而并非依赖SirT1活性；同时证实氧化应激状态下STAT3防护作用同细胞衰老的调节作用没有关联。综上所述,本研究认为由于SirT1和STAT3之间特殊的相互作用,因此在抗氧化应激过程中SirT1和STAT3功能之间存在一种平衡机制。结论：1.外源性氧化剂H2O2和ox-LDL可诱导人视网膜色素上皮细胞ARPE-19细胞发生氧化应激反应,导致显著的细胞氧化损伤,如增值下降、凋亡增加,ROS水平身高及细胞衰老显著。2.氧化应激损伤能造成SirT1和STAT3功能紊乱从而导致RPE损伤。3. STAT3能保护ARPE-19细胞抗氧化应激损伤,独立调节细胞衰老。4.氧化应激过程中SirT1对STAT3表达起到负向调节作用。而SirT1和STAT3对RPE起到了抗氧化应激的作用。以上这些结果提示在抗氧化应激的过程中SirT1和STAT3之间存在平衡机制,提示在AMD的治疗过程中需联合应用SirT1和STAT3。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：武汉大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R774.5

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本文编号：2370455