【摘要】：研究目的 通过建立不同程度的间歇缺氧动物模型,模拟不同程度睡眠呼吸暂停低通气综合征(SAHS)患者的缺氧状态,研究不同程度间歇缺氧对大鼠脑细胞凋亡发生发展的意义；对缺氧动物模型实施21%氧干预后,观察其对脑组织病理变化的影响,加深对SAHS的认识,为早期干预SAHS病情的发生与发展提供科学依据；观察对间歇缺氧进行21%氧干预后,大鼠脑内HIF-1, iNOS表达的变化,探讨二者在间歇缺氧神经细胞凋亡中的作用,同时阐明这一变化对评估缺血性脑血管疾病的治疗价值的意义。材料与方法 健康SD大鼠42只,适应性饲养1周。实验起始阶段：42只中随机选取6只作为0周的参考值(A组)。剩余36只大鼠随机分为三组,对照组(n=12)；轻度间歇缺氧组(n=12,相当于轻度OSAS, AHI=15);重度间歇缺氧组(n=12,相当于重度OSAS, AHI=40),各组以普通饲料、普通饮水饲养60天。每日9：00至16：00时将各组大鼠置于各实验箱中,共7h,16:00后使大鼠生活于大气环境中。各组在试验30天后随机取6只大鼠(BN组,BQ组,BZ组),予以取脑、原位细胞凋亡检测(TUNEL)、电镜检查,应用免疫组化,Western Blot对脑内HIF-1α, iNOS进行蛋白水平的检测。各组剩余大鼠(CN组,CQ组,CZ组)予以正常氧环境下继续饲养,30天后行上述相同检查。结果应用SPSS17.0软件进行统计分析。结果 1.神经细胞形态学变化： 1.1HE染色光学显微镜下,神经细胞核呈蓝黑色,胞浆呈淡红色。A组,BN组SD大鼠海马区可见数层锥体神经元,细胞形态规则；BQ, BZ各组中,从形态学观察有不同程度的改变,海马区锥体神经元出现核固缩、胞质浓缩、细胞体急剧变小等现象,以此判断可能有细胞凋亡的发生。经过21%氧干预30天后,试验结果发现：干预组(CQ, CZ组)神经细胞凋亡情况有所好转,但部分神经元细胞仍有排列不规则,形态改变的情况,未能恢复至初始水平。 1.2透视电镜检查发现：经过30天间歇缺氧,间歇缺氧组的脑组织病理较正常氧组有显著变化,且重度间歇缺氧组较轻度间歇缺氧组改变更为明显,表现为大鼠脑组织神经细胞核双层膜结构破坏,部分线粒体水肿扩张,细胞质中可见空泡。经过21%氧干预30天后,干预组神经细胞凋亡情况有所好转,但部分神经细胞仍有细胞形态的变化,未能恢复至初始水平。 1.3TUNEL实验显示：对照组(A组,BN组)SD大鼠海马区可见神经细胞形态规则,排列整齐紧密；缺氧组(BQ, BZ)中,被染成棕黄色或棕褐色凋亡细胞增多,以重度间歇缺氧组增多最为明显(14.83±2.48VS18.67±2.66VS32.67±4.18VS49.17±4.36)。间歇缺氧组(BQ, BZ组)明显高于对照组(A,BN组),差异有统计学意义(P0.01)；轻度间歇缺氧组和重度间歇缺氧组之间两两比较差异有统计学意义(P0.01)。经过21%氧干预30天后,试验结果发现：间歇缺氧干预组(CQ, CZ组)神经细胞凋亡情况有所好转(24.00±3.90VS31.67±2.50),但未能恢复至初始水平。间歇缺氧干预组(CQ, CZ组)高于对照组(A, BN, CN组),差异有统计学意义(P0.01)；和缺氧组(BQ, BZ组)之间比较差异有统计学意义(P0.01)。凋亡神经细胞主要集中在海马区,皮层。 2. iNOS表达的比较 常氧对照组(A,BN组)大鼠脑组织内散在分布少量iNOS阳性细胞(23.46±3.5501,24.17±1.4452)。在实验组,不论是轻度间歇缺氧组还是重度间歇缺氧组均可见较多的着色细胞(37.01±4.0473,53.34±8.0801)。间歇缺氧组(BQ, BZ组)明显高于对照组(A, BN组),差异有统计学意义(P0.01)；轻度间歇缺氧组和重度间歇缺氧组之间两两比较差异有统计学意义(P0.01)；经21%氧干预30天后,干预组(CQ, CZ组)脑内iNOS阳性染色细胞表达恢复至初始水平(24.6±8.1662,24.77±6.6268),干预组(CQ,CZ组)和间歇缺氧组(BQ,BZ组)比较差异有统计学意义,和对照组(A, BN, CN组)比较差异无统计学意义(P0.05)。iNOS阳性染色细胞主要集中在大脑皮层及海马区,不仅见于神经元,神经胶质细胞中亦有表达。 WestemBlot检测结果显示：缺氧后,实验组(BQ, BZ组)iNOS较对照组(A,BN组)表达增多,以慢性重度间歇缺氧组最为明显(140.01±1.7147VS151.52±19.9948VS376.52±38.9234VS585.17±35.1067)。间歇缺氧组(BQ, BZ组)明显高于对照组(A,BN组),差异有统计学意义(P0.01)；轻度间歇缺氧组(BQ组)和重度间歇缺氧组(BZ组)之间比较差异有统计学意义(P0.01)。经21%氧干预30天后,干预组(CQ, CZ组：170.59±42.5984,172.45±30.2081)和间歇缺氧组(BQ,BZ组)比较差异有统计学意义,和对照组(A, BN, CN组)比较差异无统计学意义(P0.05),各组脑内iNOS蛋白表达恢复至初始水平。 3.HIF-1α表达的比较 常对照组(A, BN组)大鼠脑组织内HIF-1α呈弱表达,在间歇缺氧组(BQ,BZ组)尤其是重度间歇缺氧组可见着色细胞明显增多(12.35±4.7915VS13.55±5.7289VS27.61±4.0600VS36.81±2.4887)。间歇缺氧组(BQ, BZ组)明显高于对照组(A,BN组),差异有统计学意义(P0.01)；轻度间歇缺氧组和重度间歇缺氧组之间比较差异有统计学意义((P0.01)；经21%氧干预30天后,各组脑内HIF-1α阳性染色细胞表达恢复至初始水平,干预组(CQ, CZ组：13.70±5.2587,14.22±6.5862)和间歇缺氧组(BQ, BZ组)比较差异有统计学意义,和对照组(A,BN,CN组)比较差异无统计学意义(P0.05)。HIF-1α阳性染色细胞主要集中在海马及皮层区。 WesternBlot检测结果显示：缺氧后,实验组(BQ,BZ组)HIF-1α较对照组(A,BN组)表达增多,以慢性重度间歇缺氧组最为明显(112.60±11.2176VS136.26±19.994VS338.25±81.6125VS488.63±86.4614)。间歇缺氧组(BQ,BZ组)明显高于对照组(A,BN组),差异有统计学意义(P0.01)；轻度间歇缺氧组(BQ组)和重度间歇缺氧组(BZ组)之间两两比较差异有统计学意义(P0.01)。经21%氧干预30天后,干预组(CQ, CZ组：158.44±10.631,167.79±34.505)和间歇缺氧组(BQ, BZ组)比较差异有统计学意义,和对照组(A, BN, CN组)比较差异无统计学意义(P0.05),各组脑内HIF-1α蛋白表达恢复至初始水平。 结论 1.间歇缺氧易诱导脑内特定部位神经细胞凋亡,主要表现为皮层和海马区神经元细胞凋亡增加,这可能是SAHS导致认知功能障碍的主要原因。 2.不同缺氧方式所导致神经细胞凋亡的程度是不同的,说明神经细胞的凋亡不仅仅是由缺氧本身所致,而且与缺氧的方式有关。 3.间歇缺氧有效刺激海马区iNOS和HIF-1α的蛋白水平高表达,二者共同参与了神经系统缺氧应答反应。不同程度缺氧方式所导致神经细胞凋亡的程度是不同的,其HIF-1α及iNOS在脑内的蛋白表达也不同。 4.缺氧干预后,脑组织损伤有一定程度的改善,可能与机体内氧自由基代谢恢复平衡有关。缺氧程度不同,氧化应激强度不同,早期纠正缺氧,改善氧化应激状态,可促进神经细胞损伤修复。
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【学位授予单位】：复旦大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R766
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本文编号：
2373775
