XIAP-ShRNA对老年性聋小鼠听觉皮层GABA能神经元凋亡的作用

发布时间：2019-04-10 15:16

【摘要】：研究背景及目的：老年性聋(presbycusis)是随年龄增长而引起听觉器官衰老、退变进而出现的双侧耳对称的、缓慢进行性的感音神经性听力减退，其病因主要可归纳为遗传性因素和环境因素共同作用的结果，其中对后天环境因素与老年性聋的关系的影响多集中于环境噪音、耳毒性药物、糖尿病、心血管病等等这些方面。在对老年性聋的研究中发现该病重要的病理学变化是听觉神经细胞的凋亡，并且研究显示老年性聋可能是中枢听觉系统与外周听觉系统功能联合降低衰变的结果。 X染色体相关凋亡抑制蛋白(X-chromsome-linkedinhibitor of apoptosis protein,XIAP)作为哺乳动物类凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein,IAP)家族中的重要成员，可同时在运动神经和感觉神经系统中表达,可通过抑制caspase蛋白酶家族激活级联反应进而抑制神经细胞的凋亡，而在初级听皮层中作为主要的分泌抑制性神经递质的GABA能神经元，其在听觉皮层的结构和信号传导编码过程中具有重要作用，本课题运用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术对听觉皮层GABA能神经元中XIAP基因的表达进行干扰，证明XIAP的表达水平对听觉皮层GABA能神经元的凋亡有重要作用，，并揭示GABA能神经元在老年性聋疾病发生及发展中的作用。为老年性聋的发生发展提供重要理论依据，为防治老年性聋提供新的参考意见。材料和方法： 1.听皮层GABA能神经元凋亡对老年性聋疾病发生发展的影响及作用。随机抽取年轻组(2月龄)、老年组(10月龄)C57BL/6J健康小鼠各20只检测ABR后，获取皮层标本，双荧光抗体间接染色-激光共聚焦检测两组听皮层GABA能神经元凋亡程度及XIAP的表达水平。 2.针对XIAP基因ShRNA干扰质粒的构建及功能鉴定。通过Gene Bank查找小鼠XIAP全组基因序列，针对该基因设计3条干扰序列，构建成干扰质粒，测序鉴定后命名为XIAP-ShRNA-A、XIAP-ShRNA-B、 XIAP-ShRNA-C，经鉴定后在体外细胞水平检验其功能及作用效果，即：原代培养孕14~16天C57/BL6J小鼠大脑皮层神经细胞，纯化并进行β-tubulin荧光染色鉴定；同批次细胞导入XIAP-ShRNA干扰质粒，经RT-PCR、western-blot检测神经元内XIAP表达水平；流式细胞术检测导入后神经元凋亡情况，证明其功能效果并筛选最佳干扰序列质粒。 3.活体内检测XIAP-ShRNA干扰质粒对老年性聋听皮层GABA能神经元的作用。在立体定位仪及微量注射仪的帮助下将XIAP-ShRNA质粒导入听皮层，并于导入前、导入后14天和1月，检测ABR，并利用TUNEL法，检测年轻组及老年组C57BL/6J小鼠听觉皮层GABA能神经元凋亡，XIAP的表达水平，确定皮层神经元凋亡程度及其与各自对照组差异。并通过检查听觉皮层中caspase-3的表达情况探讨GABA神经元凋亡的机制。结果： 1.年轻组小鼠ABR检测1KHz、2KHz、4KHz、8KHz、16KHz听力阈值分别为23.50±3.15dB SPL、32.75±4.99dB SPL、40.5±5.36dB SPL、60.25±5.73dB SPL、66.00±6.19dB SPL，而老年组小鼠在1KHz、2KHz、4KHz、8KHz、16KHz的听力阈值为60.50±6.69dB SPL、62.25±4.02dB SPL、65.75±4.55dB SPL、81.50±4.77dB SPL、85.50±4.44dB SPL。在各个频率上老年组听力阈值均比年轻组显著增高(P0.01)。 2.在年轻组小鼠听皮层中GABA能神经元凋亡阳性的数目较小，经图像分析系统计数，TUNEL法结合间接免疫荧光法检测听皮层凋亡的GABA能神经元数目约为：10.22±0.84，而同样的方法检测老年性小鼠听皮层中凋亡的GABA能神经元数目约为19.17±4.06。老年组小鼠比年轻组小鼠听皮层凋亡的GABA能神经元明显增多(P0.01),而年轻组小鼠听皮层的GABA能神经元XIAP表达数目较多，经分析计数，其数目为：47.83±6.77,老年组小鼠听皮层的XIAP数目为：13.27±6.94,年轻组听皮层表达XIAP的GABA能神经元明显多于老年组(P0.01)。 3.通过Gene Bank查找小鼠XIAP全组基因序列，设计针对小鼠XIAP基因的3条RNA干扰序列，合成后构建干扰质粒，测序鉴定后命名为XIAP-ShRNA-A、 XIAP-ShRNA-B、 XIAP-ShRNA-C并转染进原代培养的皮层神经细胞中，经RT-PCR、Western-Blot检测证实其能有效抑制原代培养的细胞中XIAP的表达；而流式细胞术检测转染后神经元凋亡增加，综合评定其中以XIAP-ShRNA-C干扰序列效果最为明显。 4.XIAP-ShRNA对C57BL/6J小鼠听功能的影响将XIAP-ShRNA-C质粒导入小鼠皮层后2周后，年轻组小鼠实验组ABR在1KHz、2KHz、4KHz、8KHz、16KHz阈值分别为:39.25±5.07dB SPL、44.50±6.87dB SPL、52.25±5.80dB SPL、70.00±6.52dB SPL、79.50±5.68dB SPL，年轻组对照组听力阈值为：27.25±4.87dB SPL、38.75±6.68dBSPL、48.25±5.07dB SPL、64.00±5.37dB SPL、70.50±6.30dB SPL;而老年组小鼠实验组ABR在1KHz、2KHz、4KHz、8KHz、16KHz阈值分别为:74.25±4.81dB SPL、75.75±6.75dB SPL、78.75±7.89dB SPL、85.50±4.44dB SPL、87.75±2.94dB SPL，老年组对照组为：68.50±5.02dB SPL、70.75±6.37dB SPL、73.75±6.10dB SPL、81.75±3.96dB SPL、84.50±4.15dB SPL，导入1月后年轻组实验组各频率ABR为：44.00±6.04dB SPL、49.50±5.45dB SPL、56.00±4.06dB SPL、75.00±5.92dB SPL、82.00±5.57dB SPL，而对照组为：34.50±5.89dB SPL、44.50±4.71dB SPL、52.00±4.30dB SPL、71.25±4.14dB SPL、72.25.±8.31dB SPL,导入1月后老年组实验组各频率ABR为：77.25±4.60dB SPL、80.00±3.87dB SPL、83.75±3.83dB SPL、88.25±2.86dB SPL、88.50±2.29dB SPL，而对照组为：71.50±5.26dB SPL、76.75±3.63dB SPL、81.50±5.94dB SPL、84.75±5.36dBSPL、87.00±4.30dB SPL，通过统计显示，导入2周后，年轻实验组比干扰前ABR阈值显著升高(P0.01)，与年轻对照组比较实验组ABR阈值升高(P0.05)其中以1KHz、8KHz、16KHz阈值升高最显著(P0.01)；老年实验组比干扰前ABR阈值升高(P0.05)，与相应对照组比较老年实验组ABR阈值升高(P0.05)，其中以8KHz、16KHz阈值升高最显著(P0.01)；导入1月后，与对照组比较年轻实验组ABR阈值升高(P0.05)，以1KHz、2KHz、16KHz阈值升高最显著(P0.01)，老年实验组与对照组比较ABR阈值升高(P0.05)，而由于听力阈值上限为90dB SPL，故16KHz无明显差异。 5. XIAP-ShRNA对C57BL/6J小鼠听皮层GABA能神经元凋亡的影响 TUNEL法结合间接免疫荧光法检测导入XIAP-ShRNA-C质粒后2周听皮层凋亡的GABA能神经元数目年轻实验组为：18.21±3.90，年轻对照组为：12.22±0.63。老年实验组为：7.18±2.10，老年对照组为：17.42±3.39，在年轻组，实验组凋亡的GABA能神经元比对照组多，两者相比有统计学意义(P0.05)。而在老年组，由于听皮层神经元已大量凋亡消失，因此无法直接检测出实验组凋亡的GABA能神经元，故检测值反低于对照组。但通过检测实验组对照组残存的GABA能神经元可知实验组凋亡的GABA能神经元比对照组多(P0.05)。 6. XIAP-ShRNA对C57BL/6J小鼠听皮层XIAP的影响导入2周后听皮层中表达XIAP的GABA能神经元数目年轻实验组为：35.29±9.83，年轻对照组为：52.47±4.58，实验组比对照组听皮层表达XIAP的GABA能神经元数目少，两者有统计学差异(P0.05),老年实验组为：8.45±6.62，老年对照组为：16.77±8.35，实验组比对照组听皮层表达XIAP的GABA能神经元数目少，两者有统计学差异(P0.05),而同样使用Western-Blot检测导入后小鼠皮层XIAP的表达显示年轻实验组比年轻对照组分别少23.61%，老年实验组比老年对照组分别少20.73%，两者均有统计学意义(P0.05)。 7. XIAP-ShRNA对C57BL/6J小鼠听皮层caspase-3的影响导入2周后听皮层中表达caspase-3的GABA能神经元数目年轻实验组为：19.20±4.02，年轻对照组为：14.77±4.33，实验组比对照组听皮层表达caspase-3的GABA能神经元数目多，两者有统计学差异(P0.05),老年实验组为：13.52±5.73，老年对照组为：14.27±5.29，因此时神经元已大量凋亡，因此检测值不能直接反映听皮层GABA能神经元caspase-3表达情况，而联系老年实验组的GABA神经元数为：18.62±4.38，少于对照组的29.23±7.23，两者有统计学差异(P0.05)。结论： 1.C57BL/6J小鼠随年龄增长，听力减退，其大脑听皮层GABA能神经元凋亡增加，可能是老年性聋的发病机制中的一个重要因素。 2.XIAP在不同年龄的C57/BL6J小鼠听皮层中的表达水平有差异。同时XIAP在不同年龄的C57/BL6J小鼠听皮层GABA能神经元中表达有差异，可能是导致听皮层的GABA能神经元凋亡的重要因素。 3.运用RNA干扰技术抑制原代培养的C57BL/6J小鼠皮层神经元中XIAP的表达，可导致神经元凋亡增加。 4.在C57BL/6J小鼠体内实验中，运用RNA干扰技术抑制C57/BL6J小鼠听皮层中XIAP的表达，可导致皮层caspase-3表达增多，并导致GABA能神经元数目减少，凋亡增加，引起小鼠听力下降。XIAP的表达与GABA能神经元的凋亡密切相关，可能在老年性聋发生发展过程中起重要作用。
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【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R764

【参考文献】