吸烟与不吸烟鼻息肉患者前列腺素E2受体表达差异在鼻息肉发病机制中作用的研究

发布时间：2019-04-14 18:33

【摘要】：[背景和目的] 慢性鼻窦炎(Chronic rhinosinusitis, CRS)是上呼吸道一种常见的,多发的炎症性疾病,其发病机制不明。依据是否伴有鼻息肉将CRS分为两大类：不伴鼻息肉的慢性鼻窦炎(chronic rhinosinusitis without nasal polyps, CRSsNP)和伴鼻息肉的慢性鼻窦炎(chronic rhinosinusitis with nasal polyps, CRSwNP)。嗜酸性粒细胞炎症是白种CRSwNP患者的炎症特点,但在中国患者中,超过一半的CRSwNP表现为非嗜酸性粒细胞性炎症。因此,CRSwNP又可分为嗜酸性CRSwNP (Eosinophilic CRSwNP, Eos CRSwNP)和非嗜酸性CRSwNP (noneosinophilic CRSwNP, non-Eos CRSwNP)。不同类型的CRS具有不同的组织重塑形式,并且与CRS的炎症模式密切相关。研究表明,不同的免疫调节机制参与CRSsNP、non-Eos CRSwNP和Eos CRSwNP的发病。多项研究发现前列腺素E2(E-prostanoid, EP)受体在白种人阿司匹林不耐受三联征(Samter's triad)的发病机制中发挥作用。然而迄今为止,尚未发现关于中国CRS患者的EP受体表达的研究报道。本实验比较EP1、EP2、EP3和EP4受体在阿司匹林耐受的不同类型CRS患者(CRSsNP、non-Eos CRSNP和Eos CRSwNP)中的表达,并探讨EP受体在CRS发病机制中的作用。 [方法] 鼻腔组织标本来自12例CRSsNP患者、16例non-Eos CRSwNP、12例EosCRSwNP患者和12例对照组。普通光学显微镜下对HE染色组织切片进行观察,计算黏膜上皮下浸润的炎症细胞数和腺体数,对间质水肿程度进行评分。用免疫组织化学染色S-ABC法检测四种EP受体的组织表达。分别用Real-time PCR和Western blot技术检测不同组别中EP受体的nRNA和蛋白的表达。连续切片免疫组化染色检测EP和嗜酸性粒细胞阳离子蛋白(Eosinophil cationic protein, ECP).分析EP受体与嗜酸性粒细胞之间的关系。 [结果] 不同类型的CRS组织病理学特征各异。免疫组织化学染色显示EP受体主要表达于鼻黏膜上皮、腺体和上皮下炎症细胞。EP受体mRNA在组内的表达差异显示,对照组中EP4、EP2受体较EP3和EP1受体高表达,CRSsNP和non-Eos CRSwNP中EP4受体的表达明显增加,EP受体在这三组中的表达顺序为EP4EP2EP3EP1;而Eos CRSwNP组EP2受体表达显著下调,EP1受体上调。EP受体组间比较显示,与对照组、CRSsNP和non-Eos CRSwNP相比较,EosCRSwNP中EP1受体mRNA和蛋白表达均上调,而四组间EP2、EP3和EP4受体的表达无明显差异。对Eos CRSwNP行连续切片免疫组化染色示,EP1受体主要表达于上皮下炎症细胞,其中EP1阳性的嗜酸性粒细胞占EP1阳性总细胞数的50%。 [结论] 国人CRS患者EP1、EP2、EP3和EP4受体的表达存在差异,并且不同于白种人。Eos CRSwNP中EP1表达较non-Eos CRSwNP、CRSsNP和对照组显著增加。Eos CRSwNP中EP1的表达上调可能与大量的嗜酸性粒细胞等浸润有关。四种EP受体在不同类型CRS发病中的功能有待进一步研究。 [背景和目的] 鼻息肉(chronic rhinosinusitis with nasal polyps, CRSwNP)的发病机制不明,越来越多的研究认为CRSwNP是受多种因素共同作用的结果。既往的研究发现息肉组织中EP受体参与CRSwNP的发病,而EP受体的表达受多种生理和病理性刺激的调控。吸烟是呼吸道炎症的一个主要的危险因素,在CRSwNP发病中是否起作用尚存争议,但大多数研究认为吸烟引起或加重CRSwNP的炎症反应,其机制仍不明确。有研究表明香烟烟雾可以通过改变气道和外周血炎症细胞的EP受体的表达,进而促进炎症反应,但香烟烟雾对CRSwNP中EP受体表达的影响并不清楚。本实验将CRSwNP患者分为主动吸烟(Smoking CRSwNP, S-NP)组和不吸烟(Non-Smoking CRSwNP, N-NP)组,通过比较研究EP1、EP2、EP3和EP4受体在两组疾病组织中的表达的差异,探讨吸烟与EP受体的关系,从而进一步阐明吸烟与CRSwNP发生之间的关系。 [方法] 息肉标本来自21例S-NP和28例N-NP患者。分别对两组息肉组织切片行HE染色、Alcian blue杯状细胞染色、Masson胶原纤维染色和中性粒细胞髓过氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)免疫组化染色。光学显微镜下观察S-NP组和N-NP组息肉标本组织病理学特点,计算鳞状上皮化生阳性率、上皮杯状细胞数,固有层中浸润的炎症细胞(嗜酸性粒细胞、MPO+中性粒细胞、单个核细胞)和腺体数,对间质水肿程度和基底膜厚度进行评分,纤维化水平以胶原纤维百分比表示。用免疫组织化学染色检测四种EP受体的组织表达。分别用Real-time PCR和Western blot技术检测息肉组织中EP受体的mRNA和蛋白的表达。 [结果] N-NP组和S-NP组均可见上皮增生、杯状细胞增生、基底膜增厚、间质水肿、大量炎症细胞浸润(PMNs、单个核细胞等)。与N-NP组相比,S-NP组鳞状上皮化生率、杯状细胞计数、总炎症细胞计数显著增加。S-NP组间质胶原纤维百分率比例较N-NP组更高(P=0.07)。两组嗜酸性粒细胞计数、单个核细胞计数、基底膜厚度评分、黏膜下腺体数和间质水肿评分,无统计学差异。免疫组织化学染色示两组间EP受体亚型的表达定位相同。EP受体mRNA在组内的表达差异显示,N-NP组EP2受体的表达显著低于EP1、EP3和EP4受体(EP4EP3EP1P2); S-NP组中EP2的相对低表达差异更明显(EP3EP1EP4P2).同一EP受体不同组间比较,S-NP组较N-NP组EP2、EP4受体mRNA和蛋白表达显著下调,而EP1和EP3受体表达无显著差异。 [结论] S-NP组织炎性病变比N-NP组更加明显,香烟烟雾并未改变EP受体的组织定位。S-NP和N-NP组织中EP2的相对低表达可能与息肉形成有关。主动吸烟可能通过下调鼻黏膜组织中EP2、EP4受体的表达,参与CRSwNP的发生和发展。 [背景和目的] 众多炎症介质与CRSwNP的发病机制关系密切。研究证实TNF-α、IL-6等细胞因子在鼻腔息肉组织或鼻分泌物中表达增加,在鼻息肉(chronic rhinosinusitis with nasal polyps, CRSwNP)的发病机制中发挥重要作用。我们前期工作中发现S-NP组织中EP2和EP4受体较N-NP组显著降低,S-NP的组织重塑如鳞状上皮化生、杯状细胞增生、间质纤维化程度比N-NP组更重,并且S-NP中炎症细胞浸润更加明显。提示吸烟因素可能通过改变呼吸道黏膜中EP受体的表达,介导靶细胞的活化促进炎症因子的广泛合成,进而参与CRSwNP慢性炎症的发生发展。吸烟对CRSwNP患者鼻腔组织局部和血清中细胞因子的影响鲜有报道。本部分实验进一步对比S-NP组和N-NP组息肉组织和血清TNF-α、IL-6的含量,并研究促炎因子的产生与吸烟指数(SI)是否有相关性。 [方法] 息肉和静脉血清标本来自21例主动吸烟(Smoking CRSwNP, S-NP)组,和28例不吸烟(Non-Smoking CRSw NP, N-NP)组。吸烟指数(smoking index,SI)计算方式为每天吸烟的包数x吸烟年限。采用酶联免疫吸附试验(Enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)分别检测不同组别息肉组织和血清中IL-6和TNF-α的水平,并与SI作相关性分析。 [结果] S-NP组鼻息肉组织TNF-α含量比N-NP组显著增高,IL-6水平虽无统计学差异(P=0.06),但S-NP组表达水平更高。N-NP组和S-NP组血清TNF-α、IL-6浓度无显著差异。Spearman相关分析组织TNF-α和IL-6含量与SI均无相关性。 [结论] S-NP息肉组织中促炎因子IL-6和TNF-α含量高于N-NP组,与S-NP的更重的炎性改变有关,与吸烟的强度可能无关。香烟烟雾是否通过降低EP2、EP4受体的表达,促进组织结构细胞或炎症细胞合成和释放IL-6和TNF-α等促炎因子,从而导致CRSwNP的发生发展,有待进一步研究。 [背景和目的] 人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMC)在多种炎症性疾病中发挥着重要作用,单个核细胞浸润是慢性炎症性疾病的病理特征之一。CRSwNP组织中单核细胞、淋巴细胞的聚集增加,与趋化因表达显著增高有关。研究表明单核/巨噬细胞中EP1、EP2、EP3和EP4受体均有表达,而且受病理生理机制调控。我们前期研究发现EP受体广泛表达于息肉组织中浸润的炎症细胞,吸烟鼻息肉组织中EP2、EP4受体的表达降低,可能与CRSw NP的炎症反应有关。吸烟是否影响CRSwNP患者PBMC中EP受体的表达进而影响单个核细胞的功能,目前尚无相关的报道。本实验中,我们比较S-NP组和N-NP组PBMC的EP受体表达的差异,并进行PBMC体外香烟烟雾提取物(cigarette smoke extract, CSE)刺激实验,明确香烟烟雾是否诱导PBMC的EP受体表达变化,并促进PBMC释放促炎因子。 [方法] 1.静脉血标本来自21例主动吸烟(Smoking CRSwNP, S-NP)组,和28例不吸烟(Non-Smoking CRSw NP, N-NP)组。用Ficoll密度梯度离心法提取PBMC。分别用Real-time PCR和Western blot技术检测并比较两组PBMC中EP受体的mRNA和蛋白的表达。 2.细胞体外刺激实验血液标本采自6例N-NP患者,用Ficoll密度梯度离心法提取PBMC。用不同浓度CSE(0%、0.1%、1%、10%)刺激体外培养的PBMC24小时,分别用Real-time PCR和Western blot技术检测不同浓度组PBMC中EP受体mRNA和蛋白的表达。采用酶联免疫吸附试验(Enzyme linkedimmunosorbent assay,ELISA)分别检测不同浓度CSE组上清中TNF-α、IL-6含量。 [结果] 1.PBMC的EP受体mRNA在S-NP组内的表达显示,EP4受体表达显著高于EP1、EP2和EP3受体,EP2受体表达显著高于EP1和EP3,而EP1和EP3mRNA的表达无统计学差异(EP4P2EP1EP3)。N-NP组内的EP受体表达与S-NP组相似。S-NP组和N-NP组组间比较EP受体(mRNA和蛋白)的表达均无统计学差异。 2.PMBC体外刺激实验Real-time PCR结果不同浓度的CSE(0.1%、1%、10%)刺激PBMC细胞24小时后,EP1、EP2、EP3和EP4受体mRNA的表达变化如下。 2.1EP1受体mRNA的表达与对照组相比均显著增加(P0.05)。 2.2EP2受体mRNA的表达与对照组相比均降低,统计学分析显示10%CSE组与对照组相比有显著差异(P0.05)。 2.3EP3受体mRNA的表达与对照组相比均增加,统计学分析显示CSE(1%、10%)组与对照组相比有显著差异(P0.05)。 2.4EP4受体mRNA的表达与对照组相比均显著降低,统计学分析显示1%CSE(P0.05)和10%CSE组(P0.01)与对照组相比有显著差异。 3.细胞体外刺激实验Western blot结果 3.1EP1受体蛋白条带的灰度值随CSE浓度增加逐渐增强,10%CSE组与对照组相比显著增强(P0.05)。 3.2EP2受体蛋白条带的灰度值显示10%CSE组与对照组相比显著减弱,0.1%CSE.1%CSE与对照组相比无明显差异(P0.05)。 3.3EP3受体蛋白条带的灰度值10%CSE组与对照组相比显著增强,有显著差异(P0.05)。 3.4EP4受体蛋白条带的灰度值1%CSE、10%CSE组与对照组相比显著减弱(P0.05)。 4.PMBC体外刺激实验ELISA检测结果与对照组相比,不同浓度CSE(0.1%、1%、10%)刺激PBMC24h后TNF-α、IL-6含量呈剂量依耐性升高。1%CSE和10%CSE刺激组上清中TNF-α、IL-6含量与对照组相比有统计学差异。 [结论] S-NP和N-NP组间PBMC的EP受体表达无明显差异,S-NP的EP受体表达下调可能限于组织局部。CSE通过上调N-NP患者PBMC中EP1和EP3受体的表达,下调EP2和EP4受体,促进PBMC的活化并生成TNF-α和IL-6。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R765.25

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