【摘要】：第一部分兔碱烧伤角膜缘干细胞缺乏模型的建立、评价及病理改变的研究 目的：建立能够模拟临床过程的兔碱烧伤角膜缘干细胞缺乏模型,为研究碱烧伤造成的角膜缘干细胞缺乏症(limbal stem cell deficiency, LSCD)提供科学、易行的研究模型。 方法：兔碱烧角膜缘干细胞缺乏模型的建立及评价：(1)模型建立：将浸有1mol/L NaOH溶液的内径10mm,外径18mm的环形滤纸片置于新西兰雌性大白兔右眼角膜表面(包括角膜缘)30s,去除滤纸,同时在结膜囊内滴入1%NaOH1滴,0.9%生理盐水500m1冲洗结膜囊,建立兔碱烧伤角膜缘干细胞缺乏模型。伤后抗生素眼膏点眼1次/晚,常规饲养,定期裂隙灯下观察、照相；(2)模型评价：伤后30天,待炎症稳定后,对兔碱烧伤角膜缘干细胞缺乏模型进行评价：裂隙灯照相、评分；②印迹细胞学检查角膜结膜化程度；③活体共聚焦显微镜检查角膜缘及角膜各层结构及病理改变；④泪液分泌试验检测碱烧伤后泪液分泌情况；(3)病理学检查：板层切除伤后30d新生血管化的角膜,进行石蜡包埋后HE染色行组织病理学检查。 结果：兔碱烧伤角膜缘干细胞缺乏模型的建立及评价：(1)模型建立情况：伤后即见球结膜缺血,角膜缘苍白,中央角膜轻度混浊；伤后14d见球结膜水肿、缺血,角膜混浊、水肿,虹膜纹理欠清,角膜缘新生血管长入；伤后30d,可见角膜混浊、新生血管长入、角膜上皮结膜化。(2)模型评价情况：①裂隙灯检查：根据化学伤临床评分标准对伤后30d的模型进行评分,其中86%(43眼/50眼)临床评分在6-10分,8%(4眼/50眼)临床评分6分,2%(1眼/50眼)10分,2%(1眼/50眼)角膜穿孔,2%(1眼/50眼)发生眼内炎；②印记细胞学检查示：角膜结膜化,可见杯状细胞存在；③活体共聚焦显微镜检查示：角膜缘栅栏结构消失,角膜上皮缺失,纤维组织覆盖,残存的角膜上皮细胞形态不规则,大量炎症细胞浸润,角膜上皮层及基质内见大量新生血管。④泪液分泌实验显示碱烧伤眼泪液分泌量较正常眼显著降低(p=0.0000.05)；(3)病理学检查：切除的板层角膜组织表面粗糙不平,由异常增生的结膜上皮细胞覆盖,基质内可大量炎细胞浸润,新生血管丛生 结论：碱烧伤是构建角膜缘干细胞缺乏模型的有效途径,利用碱液烧伤角膜缘可以成功的构建角膜缘干细胞缺乏模型,其方法易行、模型稳定,可以很好的模拟临床上碱烧伤造成的角膜缘干细胞缺乏症,为进一步研究提供了良好的基础。 第二部分以羊膜为载体的同种异体角膜缘上皮干细胞膜片移植术后供体细胞的命运变化 目的： 1.以羊膜为载体构建同种异体角膜缘上皮干细胞膜片,并移植到兔碱烧伤角膜缘干细胞缺乏模型眼表,建立兔碱烧伤眼表重建模型； 2.术后不同时间点检测移植的供体细胞存活情况,并在体追踪供体细胞移植后的命运变化,为临床治疗提供参考。 方法： 1.以羊膜为载体的同种异体角膜缘上皮干细胞膜片的构建：(1)细胞培养：取新西兰大白兔雄兔角膜缘组织,通过消化法获取角膜缘上皮干细胞,以去上皮羊膜为载体培养角膜缘上皮干细胞膜片。待细胞长满羊膜并复层,进行CM-DiI标记。(2)细胞状态分析：①细胞增殖能力检测：将角膜缘干细胞接种至96孔板,利用MTT法检测培养1-7天的角膜缘干细胞增殖能力；②细胞标志物检测：将少部分培养好的角膜缘上皮干细胞膜片进行HE染色、免疫荧光化学检测角膜缘干细胞标志物ABCG2、p63及角膜上皮标志物CK3表达情况；PCR检测ABCG2、p63及CK3基因表达情况；③细胞衰老、凋亡及坏死检测：将培养好的角膜缘上皮干细胞膜片进行铺片,通过p-半乳糖苷酶染色法、TUNEL法及台盼蓝-茜素红染色分别检测细胞衰老、凋亡及坏死情况。 2.同种异体角膜缘上皮干细胞膜片移植术及术后供体细胞变化情况：(1)兔眼表重建模型建立：对碱烧伤角膜缘干细胞缺乏的模型兔进行血管膜切除+同种异体角膜缘上皮干细胞膜片移植术,术后缝合睑裂,按照临床常规用药,建立兔碱烧伤眼表重建模型；(2)术后供体细胞存活情况检测：术后7,30,60,90d取角膜,进行冰冻切片,荧光显微镜下观察标记有CM-DiI的供体细胞的位置和数量；PCR检测Y染色体性别决定基因(SRY)表达情况,追踪供体细胞的存活情况。(3)术后供体细胞变化情况：术后1,3,7,30,60,90d通过组织病理学检测、免疫荧光化学及PCR等方法检测供体细胞分化、衰老、凋亡及坏死情况：①细胞分化检测：PCR检测ABCG2、p63、CK3的基因表达情况；②细胞衰老、凋亡及坏死情况检测：术后不同时间点通过β-半乳糖甘酶染色、TUNEL法及台盼蓝-茜素红染色分别检测移植术后供体细胞的衰老、凋亡及坏死情况。 结果： 1.以羊膜为载体的同种异体角膜缘上皮干细胞膜片构建：(1)细胞培养：细胞接种后可在去上皮羊膜上粘附生长,并逐渐铺满羊膜表面,气-液界面培养(air-lifting)后可复至4-5层；(2)角膜缘上皮干细胞状态分析：①细胞增殖能力检测：MTT法检测角膜缘干细胞接种后3d增殖能力显著增加,6d达到顶峰,随后增殖能力下降；②细胞标志物检测：HE染色可见细胞结构清晰,着色好,显微镜下可见羊膜胶原纤维上角膜缘上皮干细胞生长,可复至4-5层,细胞结构完整,形态正常,与羊膜连接紧密；免疫组织化学检测见ABCG2、 p63、CK3表达阳性；PCR检测ABCG2、p63、CK3基因均呈阳性表达；③细胞衰老、凋亡及坏死检测：羊膜铺片可见羊膜表面极少量衰老、凋亡及坏死细胞,细胞生存状态良好。 2.同种异体角膜缘上皮干细胞膜片移植术及术后供体细胞变化情况：(1)兔眼表重建模型建立：对18例临床评分在6-10分之间的碱烧伤模型进行了移植手术,术毕5例(27.8%)羊膜荧光素钠染色阳性；(2)术后供体细胞存活情况：术后7,30,60d均可检测到表达红色荧光的供体细胞,SRY基因亦均有表达；术后90d时,1例移植成功的角膜中仍可检测到标记红色荧光的供体细胞,PCR可检测到角膜组织中SRY基因的表达,2例移植失败的角膜中未检测到标记红色荧光的供体细胞,亦未检测到SRY基因的表达。(3)术后供体细胞变化情况：术后1d见羊膜表面出现大量凋亡细胞,衰老及坏死细胞少见；术后3d羊膜表面凋亡、坏死及衰老细胞数量明显增加,通过DAPI复染细胞核发现,这些凋亡、衰老及坏死的细胞以炎细胞为主,仅少量为移植的供体细胞,上皮细胞数量较前增多,位于表层的细胞成团分布,有逐渐连接成片的趋势；术后7d时羊膜表面凋亡、坏死及衰老细胞均较3d时略有减少,炎细胞亦有所减少,上皮细胞数量及层数明显增加,大部分区域上皮细胞连接成片；术后30d大部分模型可形成相对完整的角膜上皮,但再生的角膜上皮与正常角膜上皮形态不同,细胞层数减少,明显变薄,基底部缺乏立方形上皮细胞,以扁平细胞为主,同时羊膜下炎细胞浸润,浅基质结构紊乱,大量凋亡、衰老细胞存在于此区；术后60d部分角膜出现再次新生血管化,荧光显微镜下仅可见少量红色荧光标记的供体细胞存在于角膜上皮基底层中,且部分发生凋亡／坏死,未血管化的角膜可见1-3层扁平的角膜上皮细胞,羊膜下仍有炎细胞浸润；术后90d时绝大部分角膜发生再次血管化,羊膜下炎细胞浸润明显,仅有1例在术后90d时仍维持角膜透明,眼表稳定,组织内无炎细胞,未见凋亡及衰老细胞。 结论：以羊膜为载体的同种异体角膜缘上皮干细胞膜片可在一定程度上改善碱烧伤眼表微环境,重建眼表功能。移植后7d内是供体细胞生存的关键时期,部分供体细胞因微环境改变而发生凋亡、衰老及坏死,其中凋亡是细胞死亡的主要形式。7-30d是供体细胞的抗击打适应期,生存下来的供体细胞可逐渐在受体眼表存活并分化,形成再生上皮,再生上皮较正常上皮层数减少,抵抗力差,大部分模型在术后60d时即出现角膜再次血管化,供体细胞逐渐减少并失活,少部分至术后90d时仍维持角膜透明,供体细胞可在受体眼表稳定的存活。眼表慢性炎症微环境可能是导致供体细胞死亡的重要因素,术前及术后积极抗炎治疗是提高移植成功率的关键。 第三部分以羊膜为载体的同种异体角膜缘上皮干细胞移植术后免疫排斥反应研究 目的：检测培养的同种异体角膜缘上皮干细胞移植术后的免疫排斥反应的发生时间、特点,并观察抗排斥药物治疗效果 方法：建立兔碱烧伤眼表重建模型,并根据手术及用药的不同分为四组：A、免疫抑制剂(环孢素眼液)点眼组；B、免疫抑制剂(环孢素缓释药)结膜下植入组；C、无免疫抑制剂组；D、自体角膜缘上皮干细胞移植组。术后裂隙灯观察各组免疫排斥反应的发生情况,并根据化学伤临床评分标准进行评分。取术后14,30,60d角膜,进行冰冻切片,利用免疫荧光化学方法检测各组角膜组织中CD4+、D8+T淋巴细胞表达情况；PCR检测CD4、CD8基因表达情况。 结果：免疫排斥反应主要发生于术后30-60d,术后14d时各组均无免疫排斥发生。A、B组分别于术后30d和60d各发生1例免疫排斥,C组发生3例免疫排斥,其中2例于术后30d,1例于术后60d,D组无免疫排斥反应发生。A、B、C、D各组均可检测到角膜基质内不同程度的CD4+T淋巴细胞浸润,A、B、C组可检测到少量的CD8’T淋巴细胞,而D组未检测到CD8’T淋巴细胞。PCR显示C组术后30d时CD4及CD8基因表达量显著上调,与其他三组比较均有显著性差异。术后30d时A组CD4及CD8基因表达量均高于B组,差异有统计学意义。 结论：尽管与角膜/角膜缘移植相比,体外培养的同种异体角膜缘上皮干细胞移植术引发的免疫排斥反应时间晚,症状轻,但仍是影响供体细胞存活的重要因素。免疫抑制剂的应用有利于提高手术预后,其应用的关键时期为术后14-90d。CsA缓释药结膜下植入是一种安全、有效的抗免疫排斥治疗手段,但随缓释药物的吸收,免疫排斥反应几率升高,应及时补充免疫抑制剂。
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【学位授予单位】：武汉大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R779.65
【共引文献】
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本文编号：
2474321
