超微粉腧穴敷贴对变应性鼻炎大鼠Th细胞亚群的调控

发布时间：2019-05-30 22:28

【摘要】：研究目的：腧穴敷贴治疗变应性鼻炎因其在临床的广泛应用及确切的疗效,相关的效应及机制探讨已成为近年的研究热点,并取得了一定的研究成果。根据腧穴敷贴治疗变应性鼻炎计量学和Meta分析的结果发现,既往的研究虽然肯定了其临床疗效,但高质量的文献很少。机理研究有涉及AR发病机制中Th细胞亚群Th1/Th2的失衡关系,但并不深入,缺乏对近年免疫研究热点Th细胞另外两个亚群,Treg细胞和Th17的相关研究。目前临床使用的腧穴敷贴药物为中药散剂,存在药粉颗粒大小不一,很难混合均匀,影响贴敷效果的问题。因此,本研究拟从两个方面进行：一是采用细胞破壁,生物利用率高,能充分混匀且利于吸收的中药超微粉来进行腧穴敷贴,选取大椎、肺俞、肾俞穴治疗变应性鼻炎大鼠并观察其疗效；二是探寻超微粉治疗AR的可能机制,尤其是在既往研究的基础上深入探讨超微粉腧穴敷贴治疗对AR大鼠Th1、Th2、Treg和Th17细胞亚群的可能影响,以及细胞亚群之间的相互作用。方法：造模与分组：全部56只SD大鼠,雄性28只,雌性28只,2月龄。分笼喂养,每笼6只。按随机数字表原则分成两组：正常对照组10只(雄5,雌5)；造模组46只(雄23,雌23)。适应性喂养3天后,造模组46只大鼠予卵清蛋白10mg+Al(OH)3粉末30mmg+生理盐水1m1制成混悬液腹腔内注射,隔日1次/d,共7次,作为基础致敏。第15天开始加强免疫,予5%OVA50u1喷鼻/(侧·日)和1%OVA喷雾吸入5min,连续7天。3周后,造模组46只大鼠中,有6只死于造模过程中(雄2只,雌4只),考虑为腹腔注射误注入大肠所致,剩余40只大鼠在末次激发后30min,1小时分别观察大鼠搔鼻、喷嚏、鼻溢等行为,并采用叠加计分法进行行为学评分,所有大鼠评分均超过5分,显示本组造模全部成功。将造模成功的AR模型大鼠再按随机数字表原则随机分为4组：模型组10只(雄6只,雌4只)；丙酸氟替卡松喷鼻剂组10只(雄5只,雌5只)；普通粉组10只(雄5只,雌5只)；超微粉组10只(雄5只,雌5只)。以上5组50只大鼠进入下一步实验。穴位定位：大鼠大椎、肺俞、肾俞定位参考《常用实验动物穴位定位》。大椎位于第7颈椎与第1胸椎间,背部正中。肺俞位于第3胸椎下两旁肋间。肾俞位于第2腰椎下两旁。普通粉以及超微粉的制备：普通粉、超微粉均选用符合《中华人民共和国药典》(2005版)中药饮片炮制规范,中药广州致信中药饮片有限公司生产,批号为080710。①普通粉：白芥子粉、延胡索粉、细辛粉、生甘遂粉,按照2：2：1：1的比例配置；②超微粉：将按比例配置好的普通粉由广州市第二中医院药剂科使用微粉机,振动电机功率为1.5FW,加工15分钟,粉碎成粒径范围0.1～75μm,粒度分布中心D50≈10～15μm,达300目以上的超微粉。实验措施：①正常对照组：不采取任何处理措施；②模型组：给予生理盐水滴鼻,每日1次10天；③丙酸氟替卡松组：丙酸氟替卡松鼻喷雾剂喷鼻,每日1次,每次50gg/侧10天；④普通粉组：首先进行备皮,将按比例配置好的普通粉与新鲜姜汁调和均匀,制成约0.5cm0.5cm大小的药块,用3cm3cm次性纸胶布固定于穴位,再使用一次性透气孔胶布缠绕1-2圈以加固药贴。每次贴药4h10天；⑤超微粉组：贴敷药物改为超微粉,方法同上。实验观察指标与检测： ①行为学观察：于末次治疗后30min、1小时观察大鼠搔鼻、喷嚏、鼻溢等行为的变化。记分方法：鼻痒：轻度搔痒1-2次为1分,剧烈搔痒抓鼻四周2分。喷嚏：1-3个为1分,4-10个为2分；11个以上为3分。清涕：流至鼻孔为1分,超出前鼻孔为2分,涕流满面为3分。采用叠加计分法。 ②鼻黏膜组织HE染色及嗜酸性粒细胞计数观察：将各组大鼠于末次相关处理后,在10%水合氯醛,3ml/kg麻醉后,断头处死大鼠,迅速剥除上颌骨部皮肤,将上颌骨从颅骨中分离出来,打开鼻背,沿鼻中线切开,暴露鼻中隔和双侧鼻腔,分离鼻中隔与鼻黏膜,取双侧鼻黏膜。放入10%甲醛溶液中固定,石蜡包埋,常规切片行苏木精—伊红染色,光学显微镜下观测实验大鼠鼻黏膜组织学改变。每张病理切片随机选取5个高倍视野(1040)计数,每只大鼠鼻黏膜组织中嗜酸性粒细胞数作为一个计数。 ③透射电子显微镜观察：鼻黏膜离体后必须在2分钟内,将标本置入2.5%戊二醛液中,4℃冰箱过夜。固定后的标本用磷酸缓冲液冲洗,并浸泡过夜。1%锇酸缓冲液固定1h,梯度乙醇脱水,Epon812包埋,聚合,超薄切片,醋酸铀、枸橼酸铅双重染色,用日立JEM1200-EX透射电子显微镜观察。 ④免疫学指标测定：按照试剂盒说明采用酶联免疫法,检测血清中IL-4、TGF-β1、IFN-γ、IL-17的含量。统计方法：行为学改变采用等级资料Kruskal-Wallis多个独立样本非参数检验,嗜酸性粒细胞计数及血清IFN-γ、IL-4,TGF-β1,IL-17采用单因素方差分析,多重比较采用LSD法,采用SPSS13.0统计分析,P0.05为有统计学差异。结果：行为学观察结果：①模型组与正常对照组在鼻痒、喷嚏、清涕等记分相比,分差显著,说明应用卵清蛋白致敏建立的AR动物模型成功；②由于非参数检验不能做多重比较,从平均秩次看三种治疗手段均有效,超微粉组从评分看治疗效果最好,丙酸氟替卡松次之,普通粉效果稍差,说明超微粉、普通粉和丙酸倍氯米松鼻喷雾剂均能明显改善变应性鼻炎的鼻痒、喷嚏、清涕等症状,使过变应性鼻炎大鼠症状得以大部或部分恢复。嗜酸性粒细胞计数结果：模型组较正常对照组大幅升高,提示造模成功,超微粉组EOS计数较模型组及普通粉组显著下降(P0.01),较丙酸氟替卡松组亦显著下降(P0.05),与正常对照组相比无统计学差异(P=0.539),提示超微粉治疗大鼠变应性鼻炎局部疗效肯定；丙酸氟替卡松组及普通粉组EOS计数较模型组均明显下降(P0.05),丙酸氟替卡松组EOS计数较普通粉组明显降低,有统计学差异(P0.05),提示普通粉治疗变应性鼻炎效果不如鼻内激素。 HE染色图片分析表明：模型组与正常对照组比较炎症反应明显,毛细血管扩张、鼻黏膜上皮肿胀,渗透性增强,有大量嗜酸性粒细胞浸润固有层和血管周围,说明变应性鼻炎SD大鼠造模成功。药物干预的三组与模型组比较均很大程度的减轻了炎症反应,表现在上皮无明显肿胀,毛细血管扩张不明显,渗透性减少,以及无或者少量嗜酸性粒细胞浸润固有层和血管周围,说明药物干预组的治疗均达到预期的目标,可以缓解变应性鼻炎SD大鼠的鼻黏膜炎症反应。从三组图片结果看同EOS计数结果相似：丙酸氟替卡松组和超微粉组疗效优于普通粉组,但从HE染色的图片分析,丙酸氟替卡松组和超微粉组差异不大。透射电子显微镜结果：模型组与正常对照组比较炎症反应明显,粘膜表面不完整,纤毛稀松畸形,见粗短纤毛、微绒毛,部分脱落,纤毛根部连接不完整,细胞内见肿胀线粒体及大小不等空泡,部分线粒体脊丢失,说明变应性鼻炎SD大鼠造模成功。药物干预的三组与模型组比较均有明显所改善,表现在粘膜表面基本完整,纤毛、微绒毛数量较模型组明显增多,细胞连接正常,超微粉组细胞内甚至可见正常内质网及线粒体,接近正常对照组的图片。说明药物干预组的治疗都达到预期的目标,可以缓解变应性鼻炎SD大鼠的鼻黏膜炎症反应。从三组图片结果看同EOS计数及HE染色结果相似：丙酸氟替卡松组和超微粉组疗效优于普通粉组,但与HE染色略微有差异的是超微粉组的透射电子显微镜图片可见细胞内正常内质网及线粒体,更接近于正常对照组的图片结果,疗效较丙酸氟替卡松组更好。血清学观察结果：IFN-γ模型组较正常对照组大幅降低,提示造模成功,超微粉组IFN-γ较模型组、普通粉组及丙酸氟替卡松组显著升高(P0.05),与正常对照组相比无统计学差异(P=0.584),丙酸氟替卡松组较模型组含量升高,有统计学差异(P0.05),普通粉组较模型组相比含量升高,有统计学差异(P0.05),而丙酸氟替卡松与普通粉之间无统计学差异(P=0.179),综合分析结果提示：超微粉、丙酸氟替卡松及普通粉治疗大鼠变应性鼻炎均显著升高了过敏导致的血清IFN-γ异常降低,同时超微粉效果最好,普通粉与鼻内激素效果相当。 IL-4模型组较正常对照组大幅升高,提示造模成功,超微粉组IL-4较模型组、普通粉组显著降低(P0.05),与正常对照组及丙酸氟替卡松组相比无统计学差异(P=-0.095、0.07),丙酸氟替卡松组较模型组含量下降,有统计学差异(P0.05),普通粉组较模型组相比含量下降,有统计学差异(P0.05),而丙酸氟替卡松与普通粉之间无统计学差异(P=0.396),综合分析结果提示：超微粉、丙酸氟替卡松及普通粉治疗大鼠变应性鼻炎均显著降低了过敏导致的血清IL-4异常升高,同时超微粉与鼻内激素效果相当。 TGF-β1模型组较正常对照组大幅升高,提示造模成功,超微粉组TGF-β1较模型组、普通粉组及丙酸氟替卡松组显著下降(P0.05),与正常对照组相比有统计学差异(P=0.05),丙酸氟替卡松组较模型组含量下降,有统计学差异(P0.05),普通粉组较模型组相比含量下降,有统计学差异(P0.05),而丙酸氟替卡松与普通粉之间无统计学差异(P=0.993),综合分析结果提示：超微粉、丙酸氟替卡松及普通粉治疗大鼠变应性鼻炎均显著降低了过敏导致的血清TGF-β1异常升高,同时超微粉效果最好,普通粉与鼻内激素效果相当。 IL-17模型组较正常对照组大幅升高,提示造模成功,超微粉组IL-17较模型组、普通粉组及丙酸氟替卡松组显著下降(P0.05),与正常对照组相比无统计学差异(P=0.903),丙酸氟替卡松组较模型组含量下降,有统计学差异(P0.05),普通粉组较模型组相比含量下降,有统计学差异(P0.05),丙酸氟替卡松组较普通粉组IL-17升高,有统计学差异(P=0.01),综合分析结果提示：超微粉、丙酸氟替卡松及普通粉治疗大鼠变应性鼻炎均降低了过敏导致的血清IL-17异常升高,同时超微粉效果最好,鼻内激素次之,普通粉稍差。结论：造模后AD大鼠行为学评分均超过5分,说明卵清蛋白腹腔注射是一种可靠地AR造模方法。综合EOS计数、组织HE染色、透射电镜及血清ELISA结果：超微粉、丙酸氟替卡松、普通粉组与模型组比均有显著差异,提示药物干预均能下调AR大鼠的炎症反应,有效治疗AR。尽管部分结果有差异,但总的趋势一致,显示超微粉疗效优于丙酸氟替卡松喷鼻剂及普通粉组,其可能机制：在药物及穴位刺激双重作用下,调整机体免疫状态,下调局部的炎症反应,同时Th细胞亚群在Treg细胞的核心调节作用下,使Th1/Th2失衡关系回归平衡,在促进Th17分化的同时,功能上又抑制了其促炎症反应,使整个精细而复杂的细胞因子网络在平衡与拮抗中发挥免疫功能。
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【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R765.21

【参考文献】