人视网膜干细胞的界定以及体外诱导分化研究

发布时间：2019-07-26 21:27

【摘要】：视网膜干细胞是一类能保持未分化状态并且能自我更新、产生视网膜各种类型细胞的细胞。在早期胚胎发育过程中及成年动物都存在。在胚胎早期发育过程中,视网膜干细胞居于视网膜细胞谱系的最顶端,最早产生的视网膜干细胞能在不断的发育过程中按照特定的顺序产生出节细胞,水平细胞,视锥细胞,无长突细胞,视感细胞,双极细胞和Muller胶质细胞；在成年脊椎动物尤其是在较低等的鱼和蛙中,睫状缘区(ciliary marginal zone, CMZ)细胞能持续终生产生出新的视网膜细胞,加入到视网膜的组织中。而在较高等的脊椎动物鹌鹑和鸡中,位于睫状缘区的细胞主要产生双极细胞和无长突细胞,在眼组织受损后加入到视网膜修补损伤。在小鼠和人类,来源于CMZ的细胞在体外培养中能形成视网膜干细胞样的细胞球,并且可以产生视网膜神经元,这些细胞被认为是成体中的视网膜干细胞。但是到目前为止,视网膜干细胞的分子特征仍不得而知。而且在早期胚胎发育中位于细胞谱系顶端的视网膜干细胞和成体视网膜干细胞是否一样也无从知晓。目前使用眼发育相关的转录因子Pax6,Sox1,Sox2,Otx2,MITF,Chx10, Six3和Rx中的一种或者组合来界定视网膜干细胞,但这会出现问题：这些转录因子中的大部分(Pax6,Sox1,Sox2,Otx2,Six3和Rx)不仅在早期眼发育中表达,在神经外胚层中也广泛表达,难以区分视网膜干细胞和神经干细胞,尤其是在体外培养的条件下。而且,作为眼发育中的“总基因”的Pax6,在哺乳动物的神经外胚层普遍表达。因此,视网膜干细胞的分子标记的问题亟待解决,这也能给视网膜干细胞的界定,分离,维持,以及今后可能的临床应用打下坚实的基础。在本研究中,我们对早期胚胎的不同时期标本进行切片染色,找到了早期胚胎眼发育的一系列相关转录因子的动态表达规律,包括Pax6,Sox1,Sox2,Otx2, MITF,Chx10,Six3,Rx。发现在胚胎眼发育的最早期,Pax6,Otx2,Six3和Rx广泛表达于神经外胚层,Soxl在视泡不表达而Sox2表达减弱。MITF仅表达于视泡背侧。而且Pax6的荧光强度在视泡部位高于周围的神经外胚层。因此,视网膜干细胞可以用三个转录因子Pax6,MITF和Soxl来界定,因此找到了人视网膜干细胞的分子标志,解决了长期以来困扰这一研究领域的难题。在早期胚胎中找到视网膜干细胞的分子标志对于我们在体外用胚胎干细胞诱导分化出视网膜干细胞有非常重要的指引意义。在我们的传统的神经分化体系中,培养12天时有4%的Pax6+/MTF+/Sox1-的细胞,而在第15天这些细胞趋于消失。这些细胞的出现及出现的时间都符合发育生物学规律。转入视网膜分化体系中培养后,第12天有13%的Pax6+/MITF+/Sox1-细胞出现,为了找到能促进视网膜干细胞产生的胞外分子,我们在培养体系中分别加入了在动物实验中报道的能促进视网膜干细胞/前体细胞的一些胞外因子,包括SHH,BMP4,FGF8,Wnt3a, DKK1和IGF。但是这些因子在体外培养的条件下并没有促进视网膜干细胞产生的作用。经过6周的培养,视网膜干细胞形成的神经球中,超过90%都是视网膜神经球。在体外诱导分化的早期阶段,是视网膜干细胞出现的时期,随着诱导分化的进行,视网膜干细胞并不维持在干细胞状态而是继续分化为神经视网膜和色素上皮细胞,形成细胞排列规律的神经视网膜细胞球和黑色的色素上皮细胞球。而分别加入向神经视网膜分化促进的因子FGF2和向色素上皮层分化促进的因子ActivinA后,能有效的向这两种特定细胞类型方向诱导。因此,我们分化系统中的视网膜干细胞能够被调控产生出神经视网膜细胞和色素上皮细胞。在LIF,CHIR99021和B27存在的条件下,视网膜干细胞能维持在未分化状态,重回诱导分化系统后,这些视网膜干细胞能重新分化为神经视网膜和色素上皮细胞。这些结果显示,从人早期胚胎发育中找到的Pax6, MITF和Sox1的确是真正的视网膜干细胞的特征性转录因子,因此解决了在视网膜发育研究领域的重要难题,而运用这一分子标志能准确在体外诱导分化体系中找到视网膜干细胞,为视网膜发育机制的研究和今后可能的细胞移植治疗视网膜疾病提供关键的细胞模型和种子细胞。
【学位授予单位】：复旦大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R774.1

【参考文献】