光遗传学技术挽救视网膜色素变性啮齿类动物视功能的研究

发布时间：2019-08-24 11:21

【摘要】：视网膜色素变性(retinitis pigmentosa,RP)疾病目前在全球范围内患者数量呈现逐年递增的趋势,它是一种因感光细胞变性而最终导致患者视觉障碍甚至视觉丧失的疾病。在过去的几十年间,人们对视网膜变性疾病的发生发展及发病机制、临床治疗等方面的研究都有了很大的进展,但尚未发现有效治疗手段。近年来,随着光遗传学技术的发展,人们期望由此为该疾病,特别是视网膜色素变性晚期病人找到复明的途径。所谓光遗传学技术,是指利用遗传学技术使目的细胞表达光敏感蛋白(能够被光激活的一大类膜蛋白),可实现对细胞的光学控制,这种结合光学和遗传学的方法称为光刺激基因工程或光遗传学。该新兴技术的关键是:研究者向实验动物靶器官内注射一种光敏感基因,这种基因能够对不同波长的光刺激出现对光反应。利用光遗传学技术控制转染光基因的细胞活动具有无损伤、可定量重复、时空分辨率高、可个性化操作、使用简单等优势,目前常用的光控离子通道型光敏感蛋白有视紫红质通道蛋白2(channelrhodopsin-2,chr2)和嗜盐菌紫质(halorhodopsin,NpHR)。以往有研究表明,在大鼠视网膜色素变性模型中,将Ch R2和(或)Np HR转染在视网膜内层神经元(神经节细胞或双极细胞)上能够产生皮层可记录的视觉诱发电位,因此被认为可以挽救视网膜色素变性大鼠的视功能。但这两种光敏感蛋白一种(chr2)来源于绿藻,而另一种(NpHR)则是嗜盐碱单胞菌属,它们相对于高等哺乳动物来说是异种来源,如果用于未来临床治疗,可能会引起免疫反应及伦理学问题。那么有没有一种光敏感蛋白本身就存在于高等哺乳类动物体内呢?人们发现在哺乳类动物及人类的视网膜中存在一种视色素melanopsin,它可以接受光刺激并产生对光反应,它也被认为是一种光敏感蛋白,但不属于光控离子通道型蛋白,而是一种光控G蛋白偶联受体蛋白,即光信号激活G蛋白经第二信使发挥作用,当给予光刺激后,可引起melanopsin蛋白分子构象产生相应变化,进而产生较慢速度的去极化动作电位来参与到整个视网膜电活动中。近年来有研究使用了视网膜变性的rd1小鼠(retinal degeneration)模型,它是由于磷酸二酯酶β亚基(Pde6b,PDEβ)基因突变而引起感光细胞(photoreceptor cell)凋亡,在出生后28天感光细胞层即基本消失,当使用光遗传学技术使小鼠视网膜神经节细胞过表达鼠来源melanopsin光敏感蛋白后,可以替代凋亡的感光细胞并明显改善视网膜变性小鼠的行为学。与rd1小鼠这一快速视网膜感光细胞变性模型相比,rcs大鼠(royalcollegeofsurgeonrat,皇家外科学院大鼠)因患有一种常染色体隐性遗传病,导致色素上皮(retinalpigmentepithelium,rpe)细胞吞噬感光细胞外节膜盘能力的缺陷,变性进展到较晚期时,感光细胞出现变性死亡,最终致视觉障碍,它是一种经典的慢性视网膜感光细胞变性动物模型,更符合临床视网膜色素变性疾病的发生发展过程。那么,我们使用同样的光遗传学技术是否也可以挽救慢性视网膜感光细胞变性鼠的视功能呢,这是我们需要探索与解决的问题。此外,melanopsin虽然在啮齿类及人类的视网膜内都存在,但以往的光遗传学技术使用的melanopsin光敏感蛋白多为啮齿类动物来源,如果应用于临床治疗,必须研究同源同种人来源melanopsin光敏感蛋白是否具有同样的视觉功能挽救作用。因此在本课题中我们假设:携带人来源的melanopsin光敏感蛋白腺相关病毒能够转染视网膜内层神经细胞、挽救视网膜变性啮齿类动物的视功能,适用于视网膜色素变性晚期光遗传学治疗。本课题采用急性视网膜感光细胞变性模型(rd1小鼠)和慢性视网膜感光细胞变性模型(rcs大鼠),研究利用光遗传学技术合成鼠来源及人来源melanopsin光敏感蛋白挽救视网膜变性啮齿类动物的视功能。本实验研究方法如下:1、采用分子生物学技术构建鼠来源melanopsin腺病毒载体及人来源melanopsin腺相关病毒载体。2、使用免疫组化及wb蛋白水平检测方法观察rcs大鼠在视网膜变性过程中melanopsin光敏感蛋白的表达变化;采用全细胞膜片钳技术记录,特定光谱刺激后转染细胞的电反应。并在鼠来源melanopsin光基因遗传学技术转染(视网膜下腔转染)后3周、5周、7周行全视网膜电图(fergflashelectroretinogram)及行为学openfield实验,研究鼠来源melanopsin光基因蛋白能否挽救rcs大鼠的视功能。3、构建人来源melanopsin腺相关病毒,通过免疫组化染色视网膜铺片观察病毒转染效率,以比较玻璃体腔与视网膜下腔转染方法的优劣;以及采用全细胞膜片钳技术记录,特定光谱刺激后转染神经的电反应。4、人来源melanopsin腺相关病毒转染rd1小鼠视网膜后30天、45天行闪光视觉诱发电位(fvep)检测及行为学openfield和条栅视动追随视敏度检测,研究利用光遗传学技术是否能够挽救视网膜快速变性rd1小鼠的视功能。5、人来源melanopsin光基因遗传学技术转染(玻璃体腔/视网膜下腔转染)rcs大鼠后30天、45天、60天行全视网膜电图(ferg)/闪光视觉诱发电位(fvep)检测及行为学openfield和条栅视动追随视敏度检测,研究利用光遗传学技术是否能够挽救rcs大鼠变性晚期的视功能,并比较两种转染方式的有效性。主要实验结果如下:1、成功构建鼠来源melanopsin腺病毒载体并验证其体外及体内转染力均较好,膜片钳全细胞记录可以记录到转染293细胞对480nm蓝光的对光反应。rcs大鼠视网膜下腔转染鼠来源melanopsin腺病毒后可以明显改善其变性晚期全视网膜电图ferg-b波幅值,且openfield行为学中转染组大鼠暗室时间明显增长。表明melanopsin光敏蛋白可以延缓rcs大鼠视网膜变性进程。2、成功构建人来源melanopsin腺相关病毒载体,膜片钳全细胞记录可以记录到在体视网膜神经节细胞对420nm蓝光的对光反应。并通过玻璃体腔及视网膜下腔转染方法转染rd1小鼠及rcs大鼠视网膜,比较在体转染率后发现视网膜下腔转染方法阳性转染区域面积更大,视网膜内神经细胞转染类型更为丰富,确定视网膜下腔转染的优势。3、rd1小鼠在出生后28天视网膜感光细胞基本全部死亡;当利用光遗传技术在小鼠变性晚期(生后30天)视网膜下腔转染人来源melanopsin腺病毒后可以使视网膜内层神经元及神经节细胞均表达外源性人来源melanopsin光敏感蛋白,并且可以改善其视觉诱发电位(fvep)p1波幅值,openfield行为学中转染组rd1小鼠的暗室时间也明显增长。表明rd1小鼠视网膜下腔转染人来源melanopsin光基因可以挽救视功能。4、rcs大鼠在出生后60天ferg-b波波形基本呈熄灭性,当利用光遗传学技术在rcs大鼠变性中期(生后40天)转染人来源melanopsin后,可以成功使视网膜内残留神经元细胞表达外源性人来源melanopsin光敏感蛋白,并且可以使变性晚期的rcs大鼠ferg-b波及fvep-p1波幅值出现明显增高,且波形恢复可维持至转染后60天,即大鼠天龄100天。在openfield行为学检测中光遗传基因转染组大鼠暗室时间明显增长,条栅视动追随行为学实验中其视敏度也有明显提高。且视网膜下腔转染方法改善效果较玻璃体腔转染更为明显。表明rcs大鼠玻璃体腔和视网膜下腔转染人来源melanopsin光基因可以延缓变性、挽救视功能。由以上实验结果得出以下结论1.研究了腺病毒和腺相关病毒转染的效率,首次成功构建了人来源melanopsin腺相关病毒载体;2.率先研究了小鼠和大鼠玻璃体腔和视网膜下不同转染方式对转染率和转染细胞类型以及功能改善的影响,确定了视网膜下腔转染的优势;3.发现鼠来源melanopsin光基因遗传学技术可以延缓RCS大鼠视网膜变性进程,可能由于腺病毒携带的基因表达不够稳定致有效期不长;4.率先发现人来源melanopsin光遗传基因技术,通过视网膜下腔干预方式可部分改善快速视网膜感光细胞变性rd1小鼠的视功能,但功能维持时间较短;5.首次报道人来源melanopsin光遗传基因技术可以成功挽救慢性视网膜感光细胞变性大鼠的视功能,延缓病变发展。结果显示光遗传学技术更适用于慢性变性动物模型,而且变性中期干预的视觉挽救效果更佳。这为视网膜色素变性晚期治疗提供了新的手段。
【图文】：

传代培养,转染,神经节细胞,培养皿

1 A 图为 293 细胞传代培养 1 天后观察，均匀散布在培养皿底部，形状为近三角形，胞体明显；B 传代培养 3 天后细胞状态良好，密度佳；C 图为转染病毒前 293 细胞状态；D 为转来源 melanopsin 腺病毒后 8 小时 293 细胞荧光表达情况。2.2.2.2 原代神经节细胞转染鼠来源 melanopsin 后的荧光表达及细胞鉴定大鼠视网膜原代神经节细胞在第一天接种时在培养瓶底均匀散在分布，呈球形体折光好；培养 24 小时后可见部分神经节细胞贴壁伸展，大部分细胞仍悬浮(图 2A养 48 小时可见贴壁神经节细胞显著增多；可换液去除表面悬浮的神经节细胞。7 右可以观察到有明显轴突、树突及轴丘。(图 2B)。转染鼠来源 melanopsin 腺病毒前见原代神经节细胞发育较成熟，细胞状态佳，可进行鼠来源 melanopsin 腺病毒转图 2C)。当转染病毒 24 小时后，可以观察到明显绿色荧光 GFP 表达(图 2D)。将细胞培养片由 24 孔细胞培养板中移出，PBS 漂洗 3 次后用 4%多聚甲醛固定爬片后进行免疫组化染色，鉴定表达绿色荧光的细胞是否为神经节细胞，结果显示染鼠来源腺病毒后表达绿色荧光的细胞可以表达神经节细胞特异性蛋白 thy1.1，

神经节细胞,腺病毒,转染细胞,来源

原代神经节细胞培养及鼠来源 melanopsin-AV 腺病毒转染细胞。 A 图为原代神经节细胞观察，可见少量细胞贴壁，其余仍未悬浮细胞；B 图为原代神经节细胞培养 7 天后，可细胞形态规则，，胞体呈类三角形隆起，轴突及树突生长较好，细胞间联系紧密；C 图为节细胞转染病毒前的状态，挑选状态佳的细胞片进行病毒转染；D 图为转染鼠来源 mela毒后 24 小时观察其荧光表达情况：可见明显绿色荧光表达。(标尺：A 、B 100μm、C、D
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R774.1

【参考文献】