TREM-1在真菌性角膜炎发病机制中的作用研究

发布时间：2019-08-29 10:32

【摘要】：目的：探讨髓样细胞表达的激发受体-1(triggering receptor expressed on myeloid cells-1, TREM-1)在真菌性角膜炎中的表达及其作用的分子机制。方法：分别以真菌性角膜炎患者、真菌性角膜炎动物模型为对象研究TREM-1在机体中的表达规律；体外培养人角膜上皮细胞,研究TREM-1在真菌感染的人角膜上皮细胞中的表达和调控机制。实验分为三部分：(1)选择2012年9月至2013年10月在青岛大学附属医院眼科就诊的真菌性角膜炎初诊患者25例(25眼)为患者实验组,并根据角膜溃疡炎症反应程度再分为轻度炎症组、中度炎症组和重度炎症组,收集角膜病灶周边角膜上皮组织；制作角膜植片后剩余的周边角膜的健康供体5例(5眼)为患者对照组,收集植片外围角膜缘2mm内角膜上皮；RT-PCR检测各组角膜上皮中TREM-1的表达及其与炎症反应程度的关系。健康Wistar大鼠随机分为空白对照组(角膜未予任何处理)、损伤对照组(刮除角膜上皮后仅覆盖角膜接触镜,不接种真菌)和真菌感染组(刮除角膜上皮后覆盖角膜接触镜,接种真菌),根据角膜感染程度进行评分；刮取各组角膜上皮行RT-PCR、Western blot检测TREM-1的表达及其与角膜感染程度的关系；完整摘除角膜组织,免疫荧光染色检测TREM-1在角膜中的定位表达。(2)体外培养人永生化角膜上皮细胞,分别加入烟曲霉菌菌丝刺激液、烟曲霉菌孢子刺激液,RT-PCR检测不同时间点角膜上皮细胞中TREM-1的表达,筛选作用显著的刺激液,Western blot检测该刺激液对TREM-1蛋白表达的影响；RT-PCR检测不同浓度LP17 (TREM-1选择性抑制剂)预处理后烟曲霉菌刺激液诱导的角膜上皮细胞TREM-1表达改变以及TREM-1阻断对烟曲霉菌刺激液诱导的角膜上皮细胞炎症因子分泌的影响。(3)研究TREM-1与Toll样受体-4(Toll like receptor-4, TLR-4)之间的协同作用,分别使用TREM-1抑制剂LP17、TLR-4抑制剂CLT-095和MyD88 (TLR信号通路下游因子)抑制剂ST2825预处理体外培养的人永生化角膜上皮细胞,Western blot检测烟曲霉菌孢子刺激液诱导的TREM-1、TLR-4和MyD88蛋白表达；RT-PCR检测分别/联合抑制TREM-1、TLR-4对烟曲霉菌孢子刺激液诱导的角膜上皮细胞炎症因子分泌的影响。结果：(1)与对照组相比,真菌性角膜炎患者轻度炎症组、中度炎症组和重度炎症组中TREM-1 mRNA的表达均显著升高,而且随炎症程度加重,TREM-1表达升高越明显,各组之间差异有统计学意义(P0.05)。动物实验中,真菌感染组8h起角膜上皮TREM-1 mRNA表达量较空白对照组不断升高,48h达到高峰,各时间点之间差异具有高度统计学意义(P0.001)；16h起,真菌感染组角膜上皮中TRME-1 mRNA的表达量均明显高于损伤对照组,差别有统计学意义(P0.001)；真菌感染组24h、48h角膜上皮TREM-1蛋白表达水平随时间升高,且均明显高于空白对照组(P0.05)；免疫荧光染色结果发现,空白对照组大鼠角膜TREM-1表达主要位于角膜上皮层,真菌感染组大鼠角膜TREM-1表达明显升高,主要位于角膜上皮和角膜基质；真菌感染组大鼠角膜炎症反应程度与角膜上皮中TREM-1表达水平呈正相关(r=0.942,P0.001)。(2)烟曲霉菌孢子刺激液刺激体外培养的角膜上皮细胞时,TREM-1表达升高较菌丝刺激液更加明显,两组差异有统计学意义(P0.05)；Western blot结果显示,烟曲霉菌孢子刺激液加入细胞中4h,TREM-1蛋白表达升高,8hTREM-1蛋白表达达到高峰,各时间点与空白对照组相比差异均有统计学意义(P0.05)；终浓度为lOng/ml、50ng/ml、100ng/ml的LP17均可抑制烟曲霉菌孢子刺激液诱导的角膜上皮细胞TREM-1 mRNA表达升高,抑制效果呈浓度依赖性,各浓度组之间TREM-1表达差异均有统计学意义(P0.05)；100ng/ml LP17能够显著抑制烟曲霉菌孢子刺激液诱导的角膜上皮细胞TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8分泌(P0.05)。(3)LP17能够显著抑制烟曲霉菌孢子刺激液诱导的角膜上皮细胞TREM-1、TLR-4和MyD88蛋白表达,CLI-095预处理也能够部分阻断烟曲霉菌孢子刺激液诱导的角膜上皮细胞TREM-1和TLR-4表达上调,此外ST2825同样可以有效抑制TREM-1表达；LP17和CLI-095预处理均能不同程度的抑制TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8分泌,两者对炎症因子的抑制程度没有明显差别(P0.05),但两种抑制剂联合使用时各种炎症因子的表达与单独抑制组相比差异均有统计学意义(P0.05)。结论：(1)TREM-1介导的炎症放大作用与真菌性角膜炎的炎症反应进程密切相关；(2) TREM-1阻断可以显著抑制真菌感染后角膜上皮细胞炎症因子的释放,是抑制角膜炎症反应的潜在靶点；(3)TREM-1与TLR-4在介导真菌感染后角膜上皮炎症反应过程中具有协同促进作用；(4)真菌诱导的角膜上皮细胞TREM-1表达上调具有MyD88通路依赖性。
【学位授予单位】：青岛大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R772.21

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本文编号：2530468