干扰长链非编码RNA Z38表达对鼻咽癌细胞增殖的影响

发布时间：2019-09-05 12:52

【摘要】：长链非编码RNA(Long non-coding RNA,lncRNA)可以通过许多种机制来发挥它的生物学功能,这些机制主要包括基因印记和染色质的重塑、调控细胞的周期和调控基因的剪接以及调控mRNA降解和mRNA的翻译等。IncRNA通过这些作用机制在不同水平进行基因表达调控。实验室前期研究发现了一个新型的长链非编码RNA基因,我们暂时命名为Z38。已证实LncRNAZ38基因高表达于肿瘤组织,低表达于癌旁组织。本研究的目的在于探讨稳定干扰LncRNAZ38基因的表达对人鼻咽癌细胞HNE1、5-8F功能和机制的影响。主要在细胞水平和分子水平上进行研究。具体开展了以下工作:(1)采用包埋shRNA-Z38的慢病毒转染进人鼻咽癌细胞HNE1与5-8F中,经嘌呤霉素筛选,获得稳定干扰的鼻咽癌细胞系。(2)采用实时荧光定量PCR方法在鼻咽癌细胞HNE1与5-8F中检测LncRNA Z38的表达水平。(3)使用MTT、平板克隆集落形成实验验、Transwell实验检测干扰LncRNA Z38表达后鼻咽癌细胞HNE1、5-8F的增殖能力和细胞迁移能力的变化。(4)采用蛋白质印迹(Western blot)的方法检测干扰LncRNA Z38表达后鼻咽癌细胞HNE1、5-8F中抑癌因子p53、p21表达水平的变化。实验结果表明,慢病毒载体介导的RNAi技术干扰鼻咽癌细胞后,显著降低了 LncRNA Z38基因的表达水平,干扰LncRNA Z38基因在鼻咽癌细胞中的表达。后通过一系列肿瘤细胞功能学实验,在细胞水平上证实了干扰LncRNAZ38的表达后,鼻咽癌细胞的增殖能力、集落形成能力降低,穿过Transwell小室的细胞数降低。后通过蛋白质印迹法检测到干扰LncRNAZ38的表达后,鼻咽癌细胞中抑癌因子p53、p21表达量上调。此结果与我们的假设一致,Z38基因是癌症相关基因之一。
【图文】：

载体,嘌呤霉素,慢病毒,转染

这种方法在肝癌和鼻咽癌以及骨肉瘤等多种类型肿瘤研究中应用越来越来普遍。逡逑本实验在ｐＧＭＬＶ－ＳＣ５－ｅＧＦＰ载体上建立靶向目的基因ＬｃｎＲＮＡ邋Ｚ３８的慢病毒干扰逡逑载体，其载体示意图如下图２．１，慢病毒载体上表达有ｅＧＦＰ基因，能够表达荧光蛋白，逡逑并且载体上还携带有嘌呤霉素的抗性基因，能够在转染后利用嘌呤霉素筛选稳定转染逡逑的细胞。逡逑基于目的基因ＬｎｃＲＮＡ邋Ｚ３８的基因序列，根据设计干扰ＲＮＡ表达序列原理，选取逡逑了最为合适的动力学参数靶点为５’－ＧＣＡＴＣＴＧＧＧＡＴＧＡＡＴＴＣＡＴＴＡ－３’，设计出干扰逡逑ＬｎｃＲＮＡ邋Ｚ３８邋表达的千扰序列为邋Ｆ：邋５’－ＧＣＡＴＣＴＧＧＧＡＴＧＡＡＴＴＣＡＴＴＡＴＴＣＡＡＧＡＧＡ逡逑ＴＡＡＴＧＡＡＴＴＣ邋ＡＴＣＣＣ邋ＡＧＡＴＧＣＴＴＴＴＴＴ－３邋’，Ｒ邋：邋５５邋－邋Ａ邋ＡＡＡＡＡＧＣ邋ＡＴＣＴＧＧＧ邋ＡＴＧ邋ＡＡＴ逡逑ＴＣＡＴＴＡＴＣＴＣＴＴＧＡＡＴＡＡＴＧＡＡＴＴＣＡＴＣＣＣＡＧＡＴＧＣ－３，。将此干扰邋ＬｎｃＲＮＡ邋Ｚ３８邋的逡逑序列导入慢病毒的载体上进行后续的转染实验。逡逑ｃｐＰＴ／ＣＴＳ逡逑｜邋ｅＧＦＰ逡逑‘逦ｐＧＭＬＶ－ＳＣ５逦—逡逑Ｍ逦ｍＰＧＫ逡逑Ａｍｐ＋邋ＴＯ逦’逡逑ｌ邋Ａ逡逑３，邋ＬＴＲ逡逑图２．１慢病毒载体图示逡逑１２逡逑

荧光,基因,嘌呤霉素,转染

（４）反应结束后，导出反应结果，计算目的基因和参照基因ｃｔ、Ａｃｔ和ｒＡＡｅｔ方法：Ｃｔ值由Ｂｉｏ－Ｒａｄ邋ＣＦＸ邋Ｍａｎａｇｅｒ软件计算给出；ＡＣｔｌ＝实验组目的基因Ｃｔ－实内参基因Ｃｔ；邋ＡＣｔ２＝阴性对照组目的基因Ｃｔ－阴性对照组内参基因Ｃｔ；邋ＡＡＣｔ＝ＡＣｔＱ２；邋２＿ＡＡＱ通过公式计算得出。结果分析利用ＧｒａｐｈＲＡＤｐｒｉＳｍ５作出柱状图和散点析Ｚ３８基因在细胞的２＿ＡＣｔ值。逡逑．４实验结果逡逑．４．１倒置显微镜下检测转染效率逡逑慢病毒载体介导ｓ＿Ａ转染进人鼻咽癌细胞ＨＮＥ１和５－８Ｆ后，由于慢病毒载带嘌呤霉素抗性基因及表达绿色荧光蛋白的基因，因此通过嘌呤霉素对细胞经行后，在倒置荧光显微镜下比较同一视野的细胞荧光照片和明场照片可以反映慢病体转染进细胞的效率，即ｓｈＲＮＡＺ３８转染进细胞的效率。结果显示，以Ｍ０Ｉ邋（感数）＝５０感染细胞细胞后，且通过嘌呤霉素浓度为３邋ｕｇ／ｍｌ的培养基筛选一周后细光蛋白表达率接近９０％，如图２．２所示，此时感染效率较为适宜，可以进行后续实验
【学位授予单位】：湖南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R739.63

【参考文献】