临床常用药物对体外培养的复发性翼状胬肉成纤维细胞抑制效果的比较

发布时间：2019-09-07 07:51

【摘要】：目的1.检测地塞米松(DXM)、干扰素α-2b(IFN-α2b)、丝裂霉素(MMC)、5氟尿嘧啶(5-FU)、环孢素A(CSA)、他克莫司(FK-506)这六种临床常用药物对体外培养人复发翼状胬肉成纤维细胞(RHPFs)的半数抑制浓度(IC50)。2.观察半数抑制浓度条件下地塞米松(DXM)、干扰素α-2b(IFN-α2b)、丝裂霉素(MMC)、5氟尿嘧啶(5-FU)、环孢素A(CSA)、他克莫司(FK-506)对体外培养的人复发翼状胬肉成纤维细胞的抑制作用。方法1.实验第一部分:于2015年5月至2016年7月收集在天津医科大学眼科医院行复发性翼状胬肉切除术的患者术中切除组织标本7例7眼,采用组织块培养法分离和常规培养成纤维细胞,采用免疫组织化学法对培养细胞进行鉴定;2.实验第二部分:加药48h后CCK-8比色法检测六种药物对RHPFs的生长抑制率,未添加药物的培养细胞作为对照组。分别计算其半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration,IC50);3.实验第三部分:流式细胞仪检测RHPFs在六种药物IC50作用48h后细胞凋亡和细胞周期的变化;免疫组化SP法检测RHPFs在六种药物IC50作用48h后增生细胞核抗原(PCNA)的表达变化。结果1.培养的细胞为长梭形,旋涡状排列,细胞中波形蛋白表达阳性,角蛋白无表达。2.CCK-8检测结果计算出DXM、IFNα-2b、MMC、5-FU、CSA、FK-506对RHPFs的IC50分别为3.5×103mg/L、6.1×102mg/L、3.2×10-1mg/L、2.2×101mg/L、6.3×101mg/L、6.0×101mg/L。3.(1)流式细胞仪结果显示RHPFs在六种药物IC50剂量下分别作用48h后,IFNα-2b组、Cs A组、MMC组、FK506组、DXM组和5-FU组凋亡细胞比例分别为(35.00±3.21)%、(30.37±1.67)%、(26.11±0.75)%、(22.01±0.07)%、(20.95±1.68)%和(19.85±0.52)%,与对照组的(11.38±2.18)%比较细胞凋亡比例均明显升高,诱导细胞凋亡能力由强到弱的药物依次为IFN、CSA、MMC、FK-506、DXM、5-FU,其中FK-506、DXM、5-FU之间的差异无统计学意义(p0.05),剩余各组间均有统计学差异(p0.05);(2)对照组G0/G1期、S期和G2/M期细胞比例分比为(85.64±2.62)%、(5.29±1.56)%和(2.73±2.66)%,各药物组G0/G1期细胞比例明显下降,S期和G2/M期细胞明显升高,总体比较差异均有统计学意义(均P0.05),说明细胞周期阻滞在S期和G2/M期,对细胞整个周期阻滞效果由强到弱依次为MMC、CSA、5-FU、DXM、IFN、FK-506,其中CSA和5-FU、5-FU和DXM、IFN和FK-506之间差异无统计学意义(p0.05),剩余各组之间差异均有统计学意义(p0.05);(3)免疫组化SP法结果显示对照组、FK506组、DXM组、5-FU组、IFN-α2b组、Cs A组和MMC组细胞中PCNA的阳性表达率分别为(95.00±2.00)%、(82.67±5.04)%、(80.00±2.78)%、(64.00±6.55)%、(38.00±3.00)%,(32.00±4.36)%和(29.67±3.02)%,总体比较差异有统计学意义(F=25.995,P0.01),各药物组细胞中PCNA阳性表达率均明显低于对照组,差异均有统计学意义(均P0.05)。PCNA阳性表达率下降程度由强到弱依次为MMC、CSA、IFN、5-FU、DXM、FK-506,其中CSA、IFN、MMC组间差异无统计学意义(p0.05),DXM、FK-506两组间差异无统计学意义(p0.05),剩余各组间均有统计学差异(p0.05)。结论DXM、IFN-α2b、MMC、5-FU、CSA、FK-506对复发翼状胬肉成纤维细胞的增殖均存在抑制作用,并且促进其凋亡,其中MMC和CSA促进细胞凋亡和抑制其增殖的作用最为显著。
【图文】：

成纤维细胞,培养细胞,上皮细胞,细胞

首橹狒橹窒潞螅嘈?5 天组织块周围有零星的细胞爬出（图1A），以组织块为中心向四周围生长，细胞的形态多为长梭形、三角形，也可见部分细胞为多边形、铺路石形。13 天后组织块间细胞长满，彼此相互接触抑制生长，此时可以进行细胞的传代。细胞传到第 2 代时长梭形、三角形的成纤维细胞中仍夹杂部分呈多边形、铺路石样形状的细胞，传到第 3 代时成纤维细胞基本完全纯化（图 1B），未见明显其他形状的细胞，，此时细胞几乎均为长梭形，细胞长满时排列紧密，呈旋涡状。体外培养的翼状胬肉成纤维细胞经免疫组化SP 法染色，波形蛋白表达阳性，位于成纤维细胞胞浆内，呈与成纤维细胞长轴一致的棕黄色网状或束状结构（图 1C），胞核内波形蛋白表达为阴性，呈蓝紫色；角蛋白在成纤维细胞的胞浆及胞核内均表达阴性，胞浆呈浅紫蓝色，胞核呈深蓝紫色。A B

G图,象限,凋亡细胞,细胞凋亡

G图 2 各种药物在 IC50 剂量下作用后 48 h 细胞凋亡的流式细胞图 LL 象细胞，LR 象限：早、中期凋亡细胞，UR 象限：晚期凋亡细胞，UL 象限：细胞。A：对照组，B：CSA 组，C：IFN-a2b，D：MMC 组，E：FK-506 组DXM 组，G：5-FU 组。与对照组相比，每组早期和中晚期凋亡细胞率均增诱导细胞凋亡能力由强到弱依次为 IFN、CSA、MMC、FK-506、DXM、其中 FK-506、DXM、5-FU 组间两两比较凋亡率无统计学差异(P>0．05)，对照组、CSA、IFN、MMC 组两两比较凋亡率均有统计学差异（P<0.05)。组、CSA、IFN、MMC 组两两比较凋亡率均有统计学差异（P<0.05)另一方面，流式细胞仪检测，药物作用人复发翼状胬肉成纤维细胞细胞周期发生明显变化，与未加药的对照组相比，药物组 G0/G1期细胞比例不同程度减少，S 期和 G2/M 期细胞比例均有不同程度增加，说明细胞周期在 S 期和 G2/M 期。SPSS 软件分析结果显示对于整个细胞周期，阻滞能力到弱依次为 MMC、CSA、5-FU、DXM、IFNα-2b、FK-506，其中 CSA 和5-FU 和 DXM、IFN 和 FK-506 之间对于成纤维细胞的细胞周期的阻滞效果
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R777.33

【参考文献】