eIF4E在鼻咽癌中的转录活化机制及其对肿瘤细胞增殖侵袭的调控作用

发布时间：2019-09-19 15:49

【摘要】：鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）由于与EB病毒感染关系密切而成为独特的头颈部肿瘤，具有转移早（初诊转移率约60%）、易复发及5年生存率低下（50%以下）等临床特点，其中易转移的特性是危害广大患者生命健康的根本原因之一。然而鼻咽癌的易转移的分子机制，目前尚不完全清楚，近年来一直是肿瘤学研究的热点之一。 新癌基因eIF4E（eukaryotic translation initiation factor4E，真核翻译起始因子4E）作为蛋白质翻译的关键因子，在翻译起始阶段对众多癌基因和生长因子的蛋白翻译起限速作用。eIF4E的异常活化可选择性启动癌基因mRNA翻译表达。已有临床研究报道eIF4E在肺癌、乳腺癌、食管癌等多种肿瘤组织中表达升高，并与这些肿瘤的侵袭、转移等密切相关。我们的前期实验结果发现，鼻咽癌转移复发组织中eIF4E高表达，提示eIF4E与鼻咽癌转移有关。章俊等在组织标本中采用免疫组化的方法初步研究发现eIF4E在鼻咽癌组织中高表达，并与LMP1的表达呈正相关，与患者5年生存率呈反比。本课题组对全球718例鼻咽癌的Meta分析证实LMP1导致鼻咽癌转移。在此基础上，本课题组在鼻咽癌CNE2细胞中转染LMP1表达质粒后，发现eIF4E基因mRNA表达水平升高。因此，我们假设：“eIF4E被LMP1诱导转录活化，进而促进鼻咽癌细胞增殖、侵袭和转移。”迄今未见相关研究报道。相对于转录水平，蛋白翻译水平的调控对于肿瘤的发生发展更为直接有效。而鼻咽癌的癌蛋白翻译水平调控研究目前报道较少，尤其是源头癌基因LMP1作为跨膜转化蛋白如何将相关促癌信号转变为一系列癌基因的翻译表达，进而引起鼻咽癌细胞生物学行为的改变，亟待更多更深入的研究。因此，本论文将就鼻咽癌细胞中eIF4E受LMP1转录活化的机制，eIF4E转录活化对于鼻咽癌增殖侵袭的调控作用进行初步探讨，以期为阐明鼻咽癌易转移机制提供新的研究思路，为临床监控鼻咽癌患者预后提供新的检测指标和治疗靶点。 【目的】 1.研究eIF4E在鼻咽癌细胞中高表达的机制。 2.研究eIF4E在鼻咽癌细胞中被LMP1诱导转录活化的机制。 3.研究eIF4E的转录活化对鼻咽癌细胞增殖和侵袭的影响。 【方法】 1.细胞株：CNE1（高分化鼻咽癌细胞株，EBV阴性），CNE2（低分化鼻咽癌细胞株，初建时EBV阳性），B95-8细胞（EB病毒感染的永生化绒猴外周血淋巴细胞株，EBV阳性，LMP1强阳性表达），以CNE1和CNE2细胞为研究对象，B95-8细胞为对照。 2.实验方法 （1）通过基因重组方法构建含eIF4E启动子的pGL3Basic-eIF4E重组质粒、eIF4E全长表达重组质粒、eIF4E shRNA重组质粒，LMP1shRNA重组质粒，c-myc-siRNA载体。 （2）利用qPCR实验检测鼻咽癌细胞及B95-8细胞中eIF4E、LMP1、c-mycmRNA表达水平。 （3）利用Western Blotting实验检测LMP1转染对鼻咽癌细胞eIF4E蛋白表达水平的影响。 （4）利用双荧光素酶报告基因实验检测eIF4E基因启动子活性。 （5）采用RNAi和慢病毒包装技术，构建eIF4E干扰慢病毒颗粒，并借助慢病毒感染实验和稳定干扰细胞筛选实验，构建稳定干扰eIF4E的鼻咽癌细胞株及对照细胞株。 （6）采用CCK8增殖实验、流式细胞术、细胞运动实验和侵袭实验，检测eIF4E转录异常对鼻咽癌细胞增殖、运动和侵袭活性的影响。 【结果】 1. eIF4E被LMP1显著诱导转录活化 1.1LMP1转染可促进eIF4E mRNA的表达 ①LMP1瞬时转染CNE1细胞，实验组出现LMP1表达，eIF4E基因的mRNA表达水平随之显著上调，是对照组的1.6倍（P 0.01）。 ②LMP1瞬时转染CNE2细胞，实验组出现LMP1表达，eIF4E基因的mRNA表达水平随之显著上调，是对照组的3.0倍（P 0.01），且比在CNE1细胞中的升高幅度大（P 0.01）。 ③LMP1稳定转染CNE1细胞，CNE1/LMP1细胞有LMP1表达，eIF4E基因的mRNA水平是对照组的1.7倍（P 0.01），与瞬时转染实验结果一致。 ④LMP1表达质粒剂量梯度瞬时转染CNE2细胞，实验组LMP1mRNA水平呈梯度升高，eIF4E基因mRNA水平也伴随LMP1表达质粒剂量梯度升高而升高（P 0.01）。 ⑤成功构建LMP1干扰质粒（LMP1-shRNA），干扰效率达65.0%以上。 ⑥RNAi技术干扰B95-8细胞LMP1表达，LMP1mRNA表达水平下调70.0%，eIF4E的mRNA表达水平下调72.0%。 1.2LMP1转染可促进鼻咽癌细胞eIF4E蛋白的表达 ①LMP1瞬时转染CNE1细胞，实验组LMP1蛋白出现表达，，eIF4E蛋白表达水平升高，是对照MOCK和vector组的2.8倍（P 0.01），与转录水平改变一致。 ②LMP1瞬时转染CNE2细胞，实验组可测得LMP1蛋白表达，eIF4E蛋白表达水平升高，是对照组的4.7倍（P 0.01），与转录水平改变一致，且比在CNE1细胞中的升高幅度大（P 0.01）。 ③LMP1稳定转染CNE1细胞，CNE1/LMP1细胞LMP1蛋白高表达，而eIF4E蛋白表达水平是对照组细胞的3.0倍（P 0.01），与瞬时转染实验结果一致。 2. eIF4E在鼻咽癌细胞中被LMP1诱导转录活化的机制 2.1LMP1转染可促进鼻咽癌细胞eIF4E启动子活性升高 ①成功构建含有eIF4E启动子序列的重组报告基因质粒。 ②瞬时LMP1转染CNE1细胞，eIF4E启动子活性比对照组增强20.0倍（P0.01）。 ③瞬时LMP1转染CNE2细胞，eIF4E启动子活性比对照组增强47.0倍（P0.01），比在CNE1细胞中的增强效果明显。 2.2在LMP1过表达状态下沉默c-myc可明显降低eIF4E的转录表达水平 ①LMP1在CNE1细胞的稳定表达使CNE1/LMP1细胞c-myc和eIF4E基因mRNA水平升高，分别为对照组的8.2和1.8倍（P 0.01）。 ②干扰LMP1，B95-8细胞的c-myc和eIF4E基因mRNA水平随LMP1表达降低而下调，分别比对照组下降54.0%和60.0%（P 0.01）。 ③在LMP1高表达状态下，干扰CNE1细胞c-myc表达，c-myc的mRNA表达下降，随之eIF4E转录表达比对照组下降35.0%（P 0.05），LMP1mRNA水平亦降低，比对照组下降30.0%（P 0.05）。 2.3eIF4E过表达可导致LMP1的转录表达水平升高 ①成功构建含有eIF4E全长序列的GFP融合重组质粒pEGFPN1-eIF4E。 ②瞬时转染eIF4E表达质粒，CNE1细胞的eIF4E的mRNA水平比对照组升高18.0倍（P 0.01），LMP1基因表达比对照组升高6.0倍（P 0.01）。 3eIF4E被LMP1诱导转录活化对鼻咽癌细胞增殖、运动和侵袭活性的影响 ①成功构建eIF4E干扰慢病毒颗粒，干扰效率可达70.0%以上。 ②成功构建稳定干扰eIF4E表达70.0%以上的细胞模型（CNE2siEp）及其空载体对照细胞株（CNE2siNC）。 ③LMP1瞬时转染CNE1细胞，细胞增殖、运动和侵袭活性分别比对照组升高1.1倍、2.5倍和1.4倍（P 0.05）。 ④LMP1瞬时转染CNE2细胞，细胞增殖、运动和侵袭活性分别比对照组升高1.1倍、3.0倍和1.6倍（P 0.05），其中运动和侵袭活性的改变比在CNE1细胞中明显。 ⑤LMP1在CNE1细胞中的稳定转染表达，与对照组相比，细胞周期出现异常，G1期细胞比例下降，S期细胞比例增加（P 0.01）；CNE1/LMP1细胞运动和侵袭活性分别比对照组升高1.7倍和1.6倍（P 0.01）。 ⑥稳定干扰eIF4E转录表达，CNE2siEp细胞出现增殖抑制，群体倍增时间延长，G1期阻滞，静止期细胞（G0/G1）比例升高，DNA合成期（S）细胞比例下降，细胞增殖活性减弱，运动和侵袭活性降低，仅为对照CNE2组的59.0-73.0%（P 0.05）。 ⑦在LMP1高表达状态下，干扰eIF4E后CNE1细胞比对照组的增殖活性下降10.0%（P 0.05），运动活性下降40.0%（P 0.01），侵袭活性降低50.0%（P 0.01）。 ⑧在LMP1高表达状态下，干扰eIF4E后CNE2细胞比对照组，增殖活性下降10.0%（P 0.05），运动活性下降63.0%（P 0.01），侵袭活性降低37.0%（P 0.01）。 【结论】 1.首次发现eIF4E在鼻咽癌细胞中可被LMP1诱导转录活化，这可能是eIF4E在鼻咽癌中高表达的直接原因。eIF4E被LMP1诱导转录导致eIF4E蛋白水平升高，提示eIF4E的转录活化在鼻咽癌发生发展中具有重要意义。eIF4E被LMP1诱导转录在低分化鼻咽癌细胞（在临床上90%鼻咽癌为低分化型，与EBV感染关系密切）中比在高分化鼻咽癌细胞（仅占临床鼻咽癌的5%，与EBV感染无关）中明显，提示eIF4E的转录活化参与EB病毒的致癌效应。在绒猴淋巴瘤B95-8细胞中eIF4E也可被LMP1诱导转录，表明eIF4E被LMP1诱导转录在EBV相关肿瘤中可能普遍存在。 2. eIF4E在鼻咽癌细胞中被LMP1诱导转录活化的可能机制是：LMP1通过诱导c-myc表达，c-myc转而结合eIF4E启动子，激活eIF4E转录活化。意外的发现是，转录表达eIF4E可提高LMP1mRNA水平，提示eIF4E可诱导LMP1转录，两个基因可能形成LMP1/eIF4E正反馈环，但eIF4E诱导LMP1表达的具体机制不详，有待进一步研究。 3. eIF4E被LMP1诱导转录活化后可促进鼻咽癌细胞增殖、运动和侵袭，而且对低分化鼻咽癌细胞比高分化鼻咽癌细胞的影响更明显，对细胞运动和侵袭活性比增殖和细胞周期的作用更明显。 4. eIF4E可能是LMP1致癌效应信号传递的关键节点，是下一步作为深入研究控制鼻咽癌增殖转移的潜在靶点。
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R739.63

【参考文献】

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1 杨静,邓锡云,邓琳,丁琳,顾焕华,易薇,曹亚;EBV LMP1通过诱导c-myc表达活化端粒酶hTERT[J];病毒学报;2003年03期

2 王雯s

本文编号：2538219