周期性低氧诱导喉癌细胞化疗抵抗的作用机制

发布时间：2019-10-30 15:45

【摘要】：头颈鳞癌是全球第六大高发癌。由于早期症状隐匿，绝大多数患者就诊时已是晚期。当前，晚期头颈鳞癌的治疗策略依旧是以手术为主的放化疗为辅的综合治疗。然而，当前的治疗方案不仅剥夺了正常的发声及吞咽功能，更重要的是，生存率近几十年未见明显的改善。因此，更深入的了解导致治疗失败的原因对于寻求有效的抗肿瘤治疗方案是至关重要的。由于肿瘤细胞的快速增殖，过度的氧消耗及异常的瘤内血管结构，实体肿瘤内部存在乏氧的区域。而且，越来越的的数据表明，瘤内低氧与恶性肿瘤的不良预后相关，包括头颈鳞癌。造成这种情况的直接原因是乏氧区域限制了肿瘤药物的浸润弥散。除此以外，低氧可以激活许多反应因子诱导肿瘤细胞对低氧适应，甚至抵抗治疗。在这些因子当中，低氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor, HIF-1α)起到了至关重要的作用，因为其是低氧相关反应网络的核心。HIF-1α由氧依赖表达的α亚基和一个持续表达的β亚基构成。在常氧条件下，α亚基通过蛋白酶体途径迅速降解，而在低氧条件下其保持稳定。HIF-1α经过磷酸化后形成活性形式。磷酸化的HIF-1α转移进入细胞核内，与低氧相关反应元件绑定转录下游一系列因子，包括抗凋亡因子Bcl-2，Survivin及Xiap，诱导血管形成的VEGF，多耐药基因(MDR)等。然而，低氧是一个笼统的概念，因为肿瘤细胞与血管的距离影响着肿瘤细胞的表型及遗传型。对于位置距离血管较远的细胞，氧气从血管弥散至肿瘤细胞具有一定的限制性，这导致相对稳定的，持续的低氧状态，被称为慢性低氧(chronic hypoxia)；然而，近血管的肿瘤细胞经历着低氧-氧复合-再低氧的周期性变化，成为周期性低氧(cyclic hypoxia)。对于前者，目前已经研究的非常广泛，而且是普遍的实验室低氧条件；至于后者，最近才被发现，其导致肿瘤恶性度增高的机制仍然有待于研究。目前，为数不多的相关研究证实周期性低氧在肿瘤治疗抵抗及转移的诱导上起着至潜在的作用。周期性低氧可以诱导HIF-1α表达增强进而对放疗产生抵抗。然而，，据我们所知，周期性低氧在头颈鳞癌中还没有相关研究。肿瘤干细胞（Cancer stem cells, CSCs）是肿瘤组织中的一种异质性群体，像正常的干细胞一样，CSCs被认为是肿瘤的起源，它们能够自我更新而不是像其他细胞一样分化死亡。这类细胞群体还具有较高的治疗抵抗特性。因此，尽管治疗后瘤体组织减小或消失，但治疗后的复发或转移归因于残存的CSCs。当前的观点认为，CSCs受其周围的低氧微环境所影响。我们曾经推测CSC可能受周期性低氧所维持。本课题给该假说提供实验证据。目的：（1）研究急性周期性低氧对喉癌细胞治疗抵抗的作用及机制。（2）观察慢性周期性低氧对喉癌细胞化疗抵抗的诱导作用及可能的机制。方法：（1）通过MTT方法检测各种低氧条件下喉癌细胞对药物顺铂的敏感性。流式细胞术检测周期性低氧条件下喉癌细胞的周期分布情况；Western Blot检测P27，CyclinD1及CDK4蛋白的表达；Western blot实验检测STAT3，p-STAT3及HIF-1α在各组的表达情况；通过建立HIF-1α稳定敲除细胞系，进一步证实HIF-1α在周期性低氧诱导的喉癌细胞化疗抵抗中的作用以及对STAT3激活的调节作用。（2）流式细胞术检测以上两种周期性低氧对喉癌细胞中CD133+细胞的富集作用。（3）Hep-2细胞反复暴露于低氧/氧复合30次，建立慢性周期性低氧作用Hep-2细胞(CIH Hep-2细胞)，通过MTT法观察Hep-2细胞和CIH Hep-2细胞的增殖情况；通过MTT法观察Hep-2细胞和CIH Hep-2细胞对顺铂的敏感性；Western blot初步观察细胞内与增殖及预后不良的因子的表达情况。结果：（1）MTT实验表明急性周期性低氧可以显著诱导喉癌Hep-2细胞对顺铂长时程及短时程处理的抵抗作用，但这种抵抗在细胞恢复正常条件培养一段时间后被逆转；流式细胞术结果显示急性周期性低氧诱导的化疗抵抗与周期分布无关；Western blot证实HIF-1α随着低氧/氧复合周期的增多呈现出递增性的表达上调而且随周期次数的递增，HIF-1α于氧复合期保持稳定；沉默HIF-1α可以逆转周期性低氧诱导的化疗抵抗作用；周期性低氧诱导的HIF-1α是由组成性激活的STAT3调节；急性周期性低氧可以显著上调CD133+细胞群比率（2）建立的CIH Hep-2细胞表现出了较高的增殖能力及对顺铂的耐药性，Western blot实验表明两种细胞中VEGF及p-STAT3表达上调结论：（1）急性周期性低氧可以显著的诱导喉癌细胞对化疗药物顺铂的抵抗作用，这种效应的机制主要是由于(低氧/氧复合)周期依赖的HIF-1α表达递增(cycle dependentevlevated expression of HIF-1α)效应而不是细胞周期变化的结果。（2）周期低氧条件下HIF-1α的表达是由组成性激活的STAT3调控。（3）急性周期性低氧所诱导的化疗抵抗不是“选择压力”的结果。（4）急性周期性低氧可以富集喉癌CD133+细胞比率（5）慢性长期的周期性低氧诱导的喉癌细胞化疗抵抗作用可能是由于内在多因子表达变化的结果。我们的研究结果所带来的临床启示：联合靶向STAT3和HIF-1α可以起到短期的逆转急性周期性低氧诱导的喉癌细胞抵抗作用，而长期的系统治疗则需靶向周期性低氧所诱导的细胞基因学不稳定性。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R739.65

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