应用细胞膜片构建管状软骨的体外体内实验研究

发布时间：2019-11-03 14:30

【摘要】：研究背景由于肿瘤、外伤所导致的气管缺损临床上至今没有理想的修复方法。目前,常用的手段是两端的端端吻合；当缺损过长时,只能利用人工材料修复气管,由于感染、排斥以及材料的变性等并发症限制其在临床的应用。软骨组织工程技术的发展使气管再生成为可能,在以往成功构建管状软骨的实验中,学者们多采用软骨细胞接种到多孔的支架材料,如PGA等,并在动物体内形成软骨。但是应用支架材料主要存在两个问题,一是细胞接种效率比较低。由于液体的流动性,很多细胞在接种时容易丢失,细胞分布也不均匀,这对构建特定形态的组织是不利的。二是软骨细胞材料复合物往往是植入有免疫缺陷的动物体内如裸鼠进行构建,而当植入具有免疫功能的动物体内时,构建的组织工程软骨质量常常不如在免疫缺陷动物内构建的满意。我们考虑可能是材料直接植入后引起了宿主组织较为强烈的炎症反应,进而影响了软骨细胞的功能。我们设想如果将可引起炎症反应的支架材料去除,利用细胞自身分泌的基质将彼此连接起来形成细胞膜片。用细胞膜片的方式可以防止细胞流失,不仅提高细胞利用率,而且避免了材料降解产物对组织形成的影响。目的研究利用羊耳软骨细胞形成软骨细胞膜片构建无细胞支架组织工程管状软骨的可行性。方法取羊耳软骨组织,胶原消化法获得软骨细胞。体外培养扩增羊耳软骨细胞至第2代(P2),通过以0.5×106/mL,1.0×106/mL,1.5×106/mL,2.0×106/mL,2.5×106/mL5个不同密度接种于35mm直径圆形培养皿,培养7天后来确定哪种细胞密度可以形成软骨细胞膜片。将所形成的软骨细胞膜片均匀包裹于不同的内支撑,分别为：打孔圆柱硅胶管,PGA包裹的打孔圆柱硅胶管,未打孔的圆柱硅胶管。然后将软骨细胞膜片-内支撑复合物植入裸鼠背部皮下,4周后取材检测。以大体观察、组织学、免疫组织化学等方法对形成的软骨进行评价。结果 P2软骨细胞经高密度接种培养1周后,以2.0×106/mL和2.5×106/mL这两种软骨细胞密度接种的可形成具有一定厚度的软骨细胞膜片,呈乳白半透明状,有光泽和弹性,可以用镊子简单地夹起,并折叠和卷曲,可操作性良好。软骨细胞膜片和打孔圆柱硅胶管内支撑复合物植入裸鼠背部皮下,4周后取材可见形成了良好的管状软骨,乳白色,有光泽,质地均匀,弹性好,具有中等偏硬的硬度。HE染色见软骨陷窝形态规则,番红0染色及Ⅱ型胶原免疫组化均成阳性表达。由于硅胶管打孔,导致软骨细胞膜片向孔内长入,最终形成的管状软骨内面凹凸不平。软骨细胞膜片和PGA包裹的打孔圆柱硅胶管内支撑复合物植入裸鼠背部皮下,4周后取材可见形成了良好的管状软骨,乳白色,有光泽,质地均匀,弹性好,具有中等偏硬的硬度。HE染色见软骨陷窝形态规则,番红0染色及11型胶原免疫组化均成阳性表达。由于硅胶管外面包裹一层PGA,可以阻止软骨细胞膜片向孔内长入,最终形成的管状软骨内面平整。但是由于PGA未能完全降解,形成的软骨不均匀,降解部位软骨形成不良。软骨细胞膜片和未打孔的圆柱硅胶管内支撑复合物植入裸鼠背部皮下,4周后取材可见形成了良好的管状软骨,内表面光滑平整,乳白色,有光泽,质地均匀,弹性好,具有中等偏硬的硬度。HE染色见软骨陷窝形态规则,番红0染色及Ⅱ型胶原免疫组化均成阳性表达。结论软骨细胞膜片复合硅胶管内支撑的方法能形成管状软骨,为气管软骨的再造提供了新的方法。
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R762

【参考文献】