【摘要】：背景葡萄膜炎从狭义上是指累及眼部虹膜、睫状体和脉络膜的炎症,从广义上是指累及眼部葡萄膜、玻璃体、视网膜以及视网膜血管的炎症[1]。根据解剖位置分类可以分为前葡萄膜炎、中间葡萄膜炎、后葡萄膜炎和全葡萄膜炎4大类;根据病因可以分为感染性葡萄膜炎和非感染性葡萄膜炎;根据临床和病理特征又可分为肉芽肿性葡萄膜炎和非肉芽肿性葡萄膜炎[2]。白塞氏病(Behcet’s disease)和Vogt-小柳原田综合征(VKH syndrome)作为在我国最为普遍的葡萄膜炎类型,其在葡萄膜炎患者中致盲率高达57%,Behcet’s病是一种以葡萄膜炎、口腔溃疡、生殖器溃疡以及多形性皮肤损害等为特征的多系统、多器官受累的疾病。Vogt-小柳原田综合征则是以双眼肉芽肿性葡萄膜炎为特征的自身免疫性疾病,常伴发脑膜刺激征、皮肤和毛发异常以及听觉功能障碍,临床常表现为弥漫性脉络膜炎、脉络膜视网膜炎以及神经视网膜炎[3-7]。上述两种疾病导致的葡萄膜炎累及组织广泛、反复发作、复发频度高,越复发炎症越重,视功能损害越重,在临床治疗中较为棘手,从而导致患者的生活质量较差[8-9]。现目前对于这两种疾病病因以及发病机制的研究均尚不完全清楚,现阶段研究显示Behcet’s病发病与多种细菌、病毒感染以及自身免疫反应有较强关联,而vogt-小柳原田综合征除了病毒感染以及自身免疫因素还可能与免疫遗传因素相关。自身免疫性因素是现目前普遍接受的一种学说,其中对于cd4+t细胞以及相关免疫因子包括il-17、ifn-γ等的研究较多[10-16]。nod样受体(nod-likereceptors,nlrs)作为一类新型模式识别受体能够与病原微生物结合从而激活机体的免疫防御机制,与其他模式受体诸如toll样受体(tolllikereceptors,tlrs)共同形成自身免疫的首要防线[17-20]。近期越来越多的研究发现nod样受体家族中的nod1和nod2受体在自身免疫性疾病中发挥着重要作用,如对树突状细胞(dentriticcell,dc)等抗原提呈细胞以及相关免疫因子有显著的调节作用[21-23]。因此我们进行以下实验:1.nod1与nod2受体在vogt-小柳原田综合征和behcet’s病患者中表达水平的研究;3.nod1与nod2受体对pbmc功能的影响;4.nod1与nod2受体对dc功能的影响;5.nod1与nod2受体对cd4+t细胞功能的影响。从而以nod1和nod2受体为切入点研究两类受体是否参与到behcet’s病和vogt-小柳原田综合征的发病机制,从而为这两类棘手的致盲性眼病的治疗寻找到重要的靶分子和突破口。第一部分nod1与nod2受体在behcet’s病与vogt-小柳原田综合征患者中mrna表达水平的研究目的:研究nod1与nod2受体在behcet’s病与vogt-小柳原田综合征患者中mrna表达水平及与两种疾病活动的相关性。方法:抽取vogt-小柳原田综合征患者(包括疾病活动程度为活动期和静止期的患者)、behcet’s病患者(包括疾病活动程度为活动期和静止期的患者)以及正常人的静脉外周血利用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(peripheralbloodmononuclearcells,pbmcs)并提取pbmcs的rna反转录成cdna,采用实时荧光定量pcr(rt-qpcr)法探讨pbmcs中nod1与nod2受体的表达。结果:1.活动期vogt-小柳原田综合征患者nod1与nod2受体在pbmcs中mrna水平的表达均显著高于正常人。2.静止期vogt-小柳原田综合征患者nod1与nod2受体在pbmcs中mrna水平的表达与正常人无明显差异。3.活动期behcet’s病患者nod1与nod2受体在pbmcs中mrna水平的表达与正常人无明显差异。4.静止期behcet’s病患者nod1与nod2受体在pbmcs中mrna水平的表达与正常人无明显差异。结论:我们的研究表明:nod1与nod2受体在活动期vkh患者pbmcs中的mrna表达均显著高于正常人,而在疾病静止期与正常人之间却无明显差异,说明nod1与nod2受体的mrna表达与vkh疾病的发生发展明显相关,活动期与静止期behcet’s病葡萄膜炎患者pbmcs中nod1与nod2受体的mrna表达与正常人无明显差异,说明nod1与nod2受体的mrna表达与bd发病机制无明显相关。第二部分nod1与nod2受体在behcet’s病与vogt-小柳原田综合征患者中蛋白表达水平的研究目的:研究nod1与nod2受体在behcet’s病与vogt-小柳原田综合征患者中蛋白表达水平及其与疾病活动的相关性方法:抽取vogt-小柳原田综合征患者(包括疾病活动程度为活动期和静止期的患者)、behcet’s病患者(包括疾病活动程度为活动期和静止期的患者)及正常人静脉外周血利用密度梯度离心分离外周血单个核细胞(peripheralbloodmononuclearcells,pbmcs)。对分离出的pbmcs使用细胞裂解法提取总蛋白,然后使用免疫印迹试验(westernblot,wb)检测正常人及病人pbmcs中nod1与nod2受体的表达。结果:1.活动期vogt-小柳原田综合征患者nod1与nod2受体在pbmcs中蛋白水平的表达均显著高于正常人。2.活动期behcet’s病患者nod1与nod2受体在pbmcs中蛋白水平的表达与正常人无明显差异。结论:我们的研究表明:活动期vogt-小柳原田综合征患者pbmcs中nod1与nod2受体的蛋白表达均显著高于正常人,在静止期则不然,进一步验证了nod1与nod2受体的表达与vkh疾病的发生发展明显相关,活动期与静止期behcet’s病葡萄膜炎患者pbmcs中nod1与nod2受体的蛋白表达与正常人无明显差异,进一步验证了nod1与nod2受体的表达与bd发病机制无明显相关。第三部分:nod1与nod2受体对vogt-小柳原田综合征患者与正常人pbmc功能的影响目的:研究nod1与nod2受体对vogt-小柳原田综合征患者与正常人pbmcs产生炎症因子的影响。方法:将从正常人和患者(活动期vogt-小柳原田综合征患者)静脉新鲜抽取的外周血进行密度梯度离心,以分离pbmcs进行培养。用酶联免疫吸附试验(enzyme-linkedimmunosorbentassay,elisa)的方法检测nod1与nod2受体在相应配体激活后对pbmcs功能的影响。结果:1.激活nod1与nod2受体后可以促进vogt-小柳原田综合征患者以及正常人炎症因子il-6、il-1β、tnf-α的分泌。2.激活nod1与nod2受体后vogt-小柳原田综合征患者炎症因子il-6、il-1β、tnf-α的分泌水平显著高于正常人。结论:结果表明,nod1与nod2受体在相应配体激活后可以明显促进pbmcs中促炎因子il-6、il-1β、tnf-α的分泌,且vogt-小柳原田综合征患者中炎症因子的分泌水平显著高于正常人,也印证了vogt-小柳原田综合征患者与正常人相比其炎症细胞的活动性。第四部分:nod1与nod2受体对dc功能的影响目的:探讨nod1与nod2受体对vogt-小柳原田综合征患者与正常人dcs表面标志以及炎症因子分泌水平的影响方法:将从正常人和患者(活动期vogt-小柳原田综合征患者)静脉新鲜抽取的外周血进行密度梯度离心,以分离pbmcs。用人cd14+t细胞磁珠进行细胞分选培养,收集cd14+t细胞,用流式细胞检测技术和elisa的方法检测nod1与nod2受体的激活对dcs成熟和功能的影响。结果:1.激活nod1与nod2受体后可以促进vogt-小柳原田综合征患者以及正常人dcs表面标志cd40、cd80、cd83、cd86、hla-dr的表达。2.激活nod1与nod2受体后可以促进vogt-小柳原田综合征患者以及正常人dcs炎症因子il-6、il-1β、tnf-α的分泌。3.激活nod1与nod2受体后vogt-小柳原田综合征患者dcs炎症因子il-6、il-1β的分泌水平显著高于正常人。结论结果表明,nod1与nod2受体的激活可以明显促进dcs表面标志的成熟以及炎症因子的分泌,表明了nod1与nod2受体与固有免疫的重要关联,也进一步印证了NOD1与NOD2受体与Vogt-小柳原田综合征发生发展的相关性。第五部分:NOD1与NOD2受体对CD4+T细胞功能的影响目的:研究NOD1与NOD2受体通过DCs对CD4+T细胞的影响方法:将从正常人和患者(活动期Vogt-小柳原田综合征患者)静脉新鲜抽取的外周血进行密度梯度离心,以分离PBMCs。用人CD4+T细胞、CD14+T细胞磁珠进行细胞分选共培养,收集CD4+T细胞,用流式细胞检测技术和ELISA的方法检测NOD1与NOD2受体的激活对CD4+T功能的影响。结果:1.激活NOD1与NOD2受体后可以提高IL-17+、IFN-γ+Th细胞所占CD4+T细胞的百分比。2.激活NOD1与NOD2受体后可以促进CD4+T细胞分泌IL-17、IFN-γ。结论:结果表明,NOD1与NOD2的激活可以通过DCs促进CD4+T细胞的分化和成熟,从而进一步揭示了NOD样受体参与Vogt-小柳原田综合征发病机制的作用通路。
【图文】：
期 Behcet’t 病患者组，静止期 Behcet’s 病患者组和健康对照组，用荧光R 的方法检测每组中 NOD1 与 NOD2 mRNA 的表达，检验方法用 Kruskal-Wt，，结果显示，活动期与静止期 Behcet 病患者 NOD1 与 NOD2 受体在 PBMCNA 水平与正常人无明显差异（图 1 C, D）
正常人对照组，用免疫印迹方法检测每组中 NOD1 与 NOD2 在 PBMCs 中蛋白水平的表达，以 β-actin 为参照，检验方法用 One-way ANOVA, Kruskal-Wallis，Mann-Whitney U test，Bonferroni correction，结果显示，活动期 BD 病患者 NOD1与 NOD2 受体在 PBMCs 中蛋白表达水平无明显差异（图 2A, B, C）。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R773.9
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