ATF5对鼻咽癌放疗抵抗细胞上皮间质化的影响

发布时间：2020-03-28 22:56

【摘要】：目的:观察X线对鼻咽癌HONE-1细胞形态、增殖、侵袭及克隆形成等功能和转录激活因子5(Activating transcription factor 5,ATF5)等蛋白表达的影响,再比较复发鼻咽癌组织和初发鼻咽癌组织ATF5蛋白表达水平差异,初步探讨ATF5参与鼻咽癌细胞放射抵抗的可能机制,为提高鼻咽癌放疗敏感性提供理论依据。方法:采用X射线常规分割照射鼻咽癌HONE-1细胞建立放疗抵抗细胞株HONE-1R;通过克隆形成实验、多靶单击模型拟合生存曲线及增殖实验鉴定HONE-1R细胞;显微镜观察并记录鼻咽癌细胞形态学变化;采用免疫组织化学法检测6例同一初发和复发鼻咽癌患者的原发灶组织及鼻咽正常组织中ATF5蛋白的表达水平;免疫细胞化学法检测X线对HONE-1细胞ATF5、E-钙黏蛋白(E-cadherin)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)蛋白表达水平的影响;细胞免疫荧光法检测X线对HONE-1细胞ATF5蛋白的细胞定位及表达变化;再构建、包装shRNA-ATF5慢病毒载体,用qRT-PCR验证shRNA-ATF5的干扰效率;克隆形成实验检测X线及shRNA-ATF5对HONE-1细胞和HONE-1R细胞克隆形成能力;多靶单击模型拟合生存曲线分析X线及shRNA-ATF5对两种鼻咽癌细胞接受2Gy X线照射后存活分数(Survival fraction at 2Gy,SF2)值的影响;CCK-8法增殖实验和Transwell小室实验分别检测X线和shRNA-ATF5对两种鼻咽癌细胞生存率、迁移力和侵袭力的影响情况。结果:(1)X线能促进鼻咽癌HONE-1细胞ATF5蛋白水平显著增加,且随X线照射剂量的增加而增加(P均0.05),其亚细胞定位由细胞浆转向于细胞核。(2)鼻咽癌HONE-1R细胞克隆形成率显著大于鼻咽癌HONE-1细胞(P0.05),HONE-1R细胞SF2值是HONE-1细胞的1.712倍;经0~10Gy X线常规分割照射的HONE-1R和HONE-1细胞,HONE-1R细胞生存率显著高于HONE-1细胞的生存率(P0.05);HONE-1R细胞迁移力、侵袭能力均较HONE-1细胞显著增加(P0.05)。(3)鼻咽癌组织ATF5蛋白表达水平显著高于鼻咽正常组织表达水平(P均0.05),亚细胞主要定位于细胞浆;局部复发鼻咽癌组织ATF5蛋白表达水平显著高于初发鼻咽癌组织(P=0.032),且亚细胞主要定位于细胞核。(4)X线能促进鼻咽癌HONE-1细胞发生上皮间质化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)且呈剂量依赖性诱导EMT分子标志物(E-cadherin、N-cadherin)表达改变;(5)shRNA-ATF5能显著下调HONE-1R细胞ATF5 mRNA表达水平(P0.05),降低HONE-1R细胞克隆形成率(P0.05),削弱HONE-1R细胞存活率、迁移力和侵袭力(P均0.05),抑制HONE-1R放射抗拒性(P0.05),且显著上调HONE-1R细胞E-cadherin蛋白表达(P0.05),下调HONE-1R细胞N-cadherin蛋白表达(P0.05)。结论:(1)ATF5参与HONE-1细胞放射抵抗,且HONE-1放射抵抗细胞发生EMT变化。(2)ATF5沉默可逆转鼻咽癌放疗抵抗细胞的EMT表型,增加鼻咽癌放疗抵抗细胞的放疗敏感性,提示ATF5蛋白可能通过介导EMT参与鼻咽癌放疗抵抗。
【图文】：

科大学硕士学位论文 帅结果X 线对 HONE-1 细胞 ATF5 蛋白表达的影响疫细胞化学法检测结果显示： X 线（10Gy、20Gy、30Gy、40Gy、50Gy割照射能促进 HONE-1 细胞 ATF5 蛋白表达显著上调，且其表达水平随剂量的增加而增加（P 均＜0.05，图 1、图 2、表 14）；ATF5 在 HONE细胞定位也发生改变，由细胞浆转向细胞核，，主要表现为细胞核表达显细胞免疫荧光法检测结果也显示：HONE-1 细胞 ATF5 蛋白主要定位于其免疫荧光强度随 X 线照射剂量的增加而增强（图 1）。

图 3 不同照射剂量对各组细胞生存率影响Fig.3 Effect of different irradiation doses on the survival rate of each groupNote：*P＜0.05，（ x±s，n=3）克隆形成实验着 X 线照射剂量（0Gy、2Gy、4Gy、6Gy、8Gy、10Gy）增加，细胞量逐渐减少；在相同照射剂量下，HONE-1R 细胞的存活克隆数1 细胞的克隆数量增加（图 4、图 5）。单击多靶模型拟合细胞存活HONE-1R 细胞 SF2值（0.786±0.05）是 HONE-1 细胞（0.459±0.03，HONE-1R 细胞 D0（1.248±0.164）是 HONE-1 细胞（1.096±0.127，HONE-1R 细胞 Dq（2.373±0.226）是 HONE-1 细胞（1.368±0.149（图 6、表 15）。
【学位授予单位】：遵义医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R739.63

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本文编号：2605029