RECK基因在中耳胆脂瘤疾病进展中的作用及机制研究

发布时间：2020-03-29 14:28

【摘要】：目的:中耳胆脂瘤是一种良性的鳞状上皮角质化增生性的病变,由鳞状层状角质化上皮细胞组成,它表现为一种含有成纤维细胞和炎性细胞的表皮样囊肿。中耳胆脂瘤的特点是细胞过度增殖,伴随的是角蛋白碎片的积累和颞骨及其周围骨结构的破坏。除导致听力损伤和耳流脓外,胆脂瘤还可以导致多种颅内外并发症,如迷路炎、面瘫、乙状窦血栓性静脉炎、脑膜炎、脑脓肿等。胆脂瘤发病机制复杂,影响因素很多,至今未明确其具体发病机制。RECK(反转录富含半胱氨酸蛋白)基因是Takahashi等在1998年将v-ki-ras转染细胞株NIH3T3中发现的新型转录抑制基因。其表达在正常组织中普遍存在,但在许多肿瘤细胞系和由多种致癌基因转化的成纤维细胞系中检测不到,与许多肿瘤和炎性疾病的发生、发展、浸润、转移密切相关,其抑制肿瘤侵袭及转移的作用是通过抑制多种基质金属蛋白酶的表达而实现。MMP-2,9是基质金属蛋白酶家族中很重要的两种,它以无活性的前体形式产生,作用非常广泛。既可降解明胶与胶原、弹性蛋白(elastin)、层粘连蛋白(laminin)A链,又能降解间质胶原和基质蛋白等。MMP基因的严格调控对组织的破坏和重建平衡至关重要。如果过表达,结缔组织破坏会导致出现病理情况,像关节炎和牙周炎。目前在很多炎性疾病中RECK均为低表达,但RECK在中耳胆脂瘤的发生发展中表达及生物学功能尚不清楚,本课题对RECK在中耳胆脂瘤中的表达及在中耳胆脂瘤疾病进展过程中的作用机制进行了研究。研究方法:1、收集2017年2月~2017年10月在盛京医院耳科病房手术的部分中耳胆脂瘤标本36例,同时收集术耳外耳道皮肤29例(开放式乳突切除术+鼓室成形术+耳甲腔成型术中废弃不用的外耳道皮肤的小碎块)作为对照组。应用RT-PCR检测中耳胆脂瘤和外耳道皮肤中RECK、MMP2、MMP9的mRNA的表达情况。应用Western Blot蛋白印迹检测中耳胆脂瘤和外耳道皮肤中MMP2、MMP9的蛋白表达情况。2、培养人永生化表皮细胞HaCaT(human immortalized keratinocyte),细胞的培养液为DMEM(含2ml-glutamine)+10%胎牛血清,培养条件为37℃,5%CO2,恒温孵箱贴壁培养,三天传代一次,传代时用0.25%胰酶恒温孵箱消化3min,重悬细胞按1:2传代。通过质粒转染构建沉默RECK基因和过表达RECK基因的HaCaT细胞。应用实时定量PCR检测RECK mRNA表达水平以评估是否成功构建沉默RECK基因和过表达RECK基因的HaCaT;通过MTS法检测沉默和过表达RECK对HaCaT细胞增殖能力的影响。结果:1、RT-PCR结果显示,中耳胆脂瘤中的RECK mRNA的相对表达量为0.723±0.099,低于外耳道皮肤1.181±0.121(P=0.004);中耳胆脂瘤中MMP2和MMP9的mRNA的相对表达量分别为11.180±3.158和99.350±31.920,显著高于外耳道皮肤2.013±0.495(P=0.012)和1.522±0.529(P=0.007);Western Blot结果显示,中耳胆脂瘤中的MMP2和MMP9的蛋白相对表达量分别为4.105±1.209和15.980±6.520,明显高于外耳道正常皮肤0.666±0.215(P=0.040)和1.033±0.375(P=0.047)。2、si-RECK转染组与con未转染组RECK mRNA相对表达量分别为0.581±0.107和1.033±0.033(P=0.016),si-RECK转染组HaCaT细胞中RECK mRNA表达明显低于con未转染组,成功沉默RECK基因。OE-RECK转染组与con未转染组RECKmRNA相对表达量分别为70.040±22.640和1.033±0.033(P=0.038),OE-RECK转染组HaCaT细胞中RECK mRNA表达明显高于con未转染组,成功过表达RECK基因。通过MTS法检测下调RECK基因后HaCaT细胞的增殖能力的变化,第24h HaCaT细胞的con组、si-RECK NC组、si-RECK组细胞增殖情况分别为1.179±0.044,1.191±0.028,1.442±0.034,si-RECK转染组HaCaT细胞增殖能力明显高于si-RECK NC组(P=0.005)和空白对照组(P=0.009);第48h HaCaT细胞的con组、si-RECK NC组、si-RECK组细胞增殖情况分别为1.540±0.088,1.548±0.109,2.071±0.116,si-RECK转染组HaCaT细胞增殖能力明显高于si-RECK NC组(P=0.030)和空白对照组(P=0.022);第72h HaCaT细胞的con组、si-RECK NC组、si-RECK组细胞增殖情况分别为1.869±0.129,1.895±0.136,3.242±0.119,si-RECK转染组HaCaT细胞增殖能力明显高于si-RECK NC组(P=0.001)和空白对照组(P=0.001),而si-RECK NC组与空白对照组HaCaT细胞增殖能力无明显差异(P0.05)。通过MTS法检测RECK基因过表达后HaCaT细胞的增殖能力的变化,第24h HaCaT细胞的con组、OE-RECK NC组、OE-RECK组细胞增殖情况分别为1.553±0.042,1.579±0.040,1.196±0.035,OE-RECK转染组HaCaT细胞增殖能力明显低于OE-RECK NC组(P=0.002)和空白对照组(P=0.002);第48h HaCaT细胞的con组、OE-RECK NC组、OE-RECK组细胞增殖情况分别为1.712±0.074,1.771±0.084,1.314±0.013,OE-RECK转染组HaCaT细胞增殖能力明显低于OE-RECK NC组(P=0.005)和空白对照组(P=0.006),而OE-RECK NC组与空白对照组HaCaT细胞增殖能力无明显差异(P0.05)。结论:1、RECK在中耳胆脂瘤中的表达低于外耳道皮肤,MMP2和MMP9在中耳胆脂瘤中的表达高于外耳道皮肤。RECK,MMP2,MMP9的表达模式可能在中耳胆脂瘤疾病进展过程中起到一定的促进作用,还可能有助于为中耳胆脂瘤的临床治疗提供新的思路。2、干扰RECK基因可以调控HaCaT细胞的增殖能力,沉默RECK促进细胞增殖,过表达RECK抑制细胞增殖,提示依据RECK基因而设计的分子诊断和基因治疗有可能应用于中耳胆脂瘤的临床治疗。
【图文】：

图 1 中耳胆脂瘤及外耳道皮肤中 RECK mRNA 的表达情况表外耳道皮肤组织，C 代表中耳胆脂瘤组织，*表示与外耳道皮肤对比 P<0.0P2 在中耳胆脂瘤中的表达高于外耳道皮肤。2 在中耳胆脂瘤中的表达明显高与外耳道皮肤，用 2-ΔΔCT 计算组的 MMP2 mRNA 相对表达量分别为 11.180±3.158 和 2.013±0学意义（P=0.012）。对样本相对灰度值分析结果显示，中耳胆脂白的相对表达量 4.105±1.209，高于外耳道皮肤 0.666±0.215（P=0

图 2 MMP2 在中耳胆脂瘤与外耳道皮肤的表达情况A 图上半部分为 MMP2 蛋白凝胶电泳图，GAPDH 作为内参，下半部分为 MMP2 蛋白相对表达水平。B 为 MMP2 在中耳胆脂瘤组织及外耳道皮肤中 mRNA 相对表达水平。N 代表外耳道皮肤，C 代表中耳胆脂瘤。*表示与外耳道皮肤对比 p<0.05。**表示与外耳道皮肤对比 P<0.01。3.3 MMP9 在中耳胆脂瘤的表达高于外耳道皮肤。中耳胆脂瘤和外耳道皮肤 MMP9 mRNA 相对表达量分别为 99.350±31.920 和1.522±0.529，，差异有统计学意义（P=0.008），对样本相对灰度值分析结果显示，胆脂瘤中 MMP9 的相对表达量 15.980±6.520 显著高于外耳道皮肤 1.033 ±0.375（P=0.047）差异具有统计学意义。如图 3 所示
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R764.2

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本文编号：2606102