环状RNA-PWWP2A介导的周细胞—内皮细胞Crosstalk在糖尿病性视网膜微血管病变中的作用及其机制研究

发布时间：2020-05-09 22:09

【摘要】：研究目的:糖尿病性视网膜病变(Diabetic Retinopathy,DR)是常见的致盲性糖尿病相关微血管病变。环状RNA(Circular RNA,circRNAs)是一组参与多种生理和病理过程的非编码RNA。本研究拟运用circRNAs微阵列芯片分析技术,观察DR模型动物视网膜组织中circRNAs的表达特征,并通过体内、外实验探究其在糖尿病性视网膜微血管病变中的调控作用,为DR的治疗提供新思路。研究方法:1.利用circRNAs微阵列芯片筛查DR模型小鼠视网膜组织中差异性表达的circRNAs,通过qRT-PCR随机验证20条表达上调和20条表达下调超过3倍的circRNAs,筛选表达上调最显著的环状RNA-PWWP2A并验证其在DR模型小鼠视网膜组织中的表达规律。2.体内实验中,通过上调或下调DR模型小鼠视网膜组织中cPWWP2A的表达量,利用Evans Blue荧光渗漏实验、ELISA法、视网膜平铺片免疫荧光染色法和胰酶消化视网膜平铺片联合PAS染色法明确cPWWP2A在DR微血管病变中的调控作用。3.体外实验中,利用cPWWP2A siRNA使周细胞内cPWWP2A表达降低,通过细胞免疫荧光法、Ki67细胞增殖实验、PI荧光染色和Caspase 3/7活性检测研究cPWWP2A表达量改变对周细胞功能的影响;血管生成联合CD31/NG2细胞免疫荧光染色法和血管内皮细胞功能屏障实验研究周细胞内cPWWP2A表达降低后对血管内皮功能的影响。4.通过生物信息分析、RNA荧光原位杂交技术(RNA Fluorscence In Situ Hybridization,RNA-FISH)、双荧光素酶基因报告和RNA-Pulldown实验明确cPWWP2A与miR-579的靶向结合。并在体内、外实验中通过改变cPWWP2A/miR-579表达量,利用视网膜平铺片免疫荧光染色法、胰酶消化视网膜平铺片联合PAS染色法、Evans Blue荧光渗漏实验、细胞免疫荧光法、Ki67细胞增殖实验、PI荧光染色和Caspase 3/7活性检测研究cPWWP2A/miR-579表达对视网膜微血管病变和周细胞功能的影响。运用双荧光素酶基因报告实验分析miR-579对血管生成素1(Angiopoietin 1,Ang 1)、Occludin和沉默信息调节因子2相关酶l(Silent mating type information regulation 2 homolog 1,SIRT 1)的靶向作用。研究结果:1.circRNAs微阵列芯片筛查共发现884种circRNAs的表达较正常对照组有明显的差异,其中有433种circRNAs表达上调,411种circRNAs表达下调。对于随机挑选的circRNAs进行qRT-PCR验证发现分别有14个表达上调和16个表达下调的circRNAs变化趋势与微阵列分析结果一致。其中有3条circRNAs表达显著上调,比较同源序列的概率后选择环状RNA PWWP2A作为本研究的靶点。2.体内实验中,沉默DR模型小鼠视网膜组织中cPWWP2A的表达后,Evans Blue荧光渗漏实验发现血管渗漏明显增加;ELISA法检测白介素(Interleukin,IL)-2、IL-6、肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factor,TNF-α)、血管内皮生长因子(Vascular endothelial factor,VEGF)和人单核细胞趋化因子(Human monocyte chemotactic protein 1,MCP-1)含量均增高;视网膜平铺片免疫荧光染色显示周细胞表面特异性标志物NG2表达量减少;胰酶消化视网膜血管平铺片联合PAS糖原染色结果显示异常形态的血管数量增多。而过表达cPWWP2A后,通过上述实验发现视网膜血管管壁渗漏减少、周细胞在视网膜血管网的覆盖率增大且异常形态的血管数量减少。3.体外实验中,通过敲低周细胞内cPWWP2A的表达,结果发现周细胞表面特异性标志物表达水平明显下降;Ki67细胞增殖实验发现细胞核内增殖信号明显减少;PI荧光染色和Caspase 3/7活性检测周细胞凋亡水平升高;血管生成实验及CD31/NG2免疫荧光染色实验发现周细胞向内皮细胞的趋附力减弱;内皮细胞屏障功能检查中发现内皮细胞间屏障被破坏。4.分子机制研究中,首先通过RNA-FISH、双荧光素酶基因报告和RNA-Pulldown实验明确了cPWWP2A与miR-579共表达于胞质并可互相结合。其次,在体内、外实验中过表达miRNA-579后发现周细胞表面标记物的表达降低;Ki67细胞增殖实验发现周细胞增殖力降低;PI染色和Caspase 3/7活性检测实验发现周细胞的凋亡水平增高;血管生成及CD31/NG2免疫荧光染色实验发现周细胞向内皮细胞的趋附力减弱。而共转染miRNA-579和cPWWP2A后,细胞增殖力较单独转染miRNA-579组明显增高、凋亡水平明显下降及周细胞趋附力减弱。而拮抗miR-579表达后,上述实验现象均明显改善。最后,通过双荧光素酶基因报告实验明确了Ang 1、Occludin和SIRT 1是cPWWP2A/miR-579调控轴的下游靶基因。研究结论:1.本项研究发现,cPWWP2A与DR具有明显相关性。在体内、外高糖环境下,cPWWP2A的表达水平均显著上调。2.动物实验表明,cPWWP2A表达沉默加重了糖尿病性视网膜微血管病变的过程。3.细胞实验表明,cPWWP2A表达沉默加重了周细胞功能的损伤,并导致周细胞-内皮细胞间Crosstalk的异常。4.cPWWP2A通过海绵样吸附miRNA-579以发挥ceRNA的作用,导致下游靶基因Angiopoietin 1/Occludin/SIRT 1表达的增加,进而参与调控周细胞功能及周细胞与内皮细胞间Crosstalk。
【图文】：

南京医科大学博士学位论文降解，，而 cPWWP2A 不易被该酶所降解(见图 1.4)，进一步验证了 cPWWP2A 符合 circRNAs 的结构特点，并较线性 RNA 分子具有明显的稳定性。接着，为了研究 cPWWP2A 与 DR 间的相关性，通过 qRT-PCR 法对 STZ诱导的 DR 模型小鼠和正常对照组小鼠的视网膜组织中 cPWWP2A 的表达量进行检测，结果发现在注射 STZ 后持续高血糖 2 个月、4 个月和 6 个月的视网膜组织中，cPWWP2A 的表达量要明显高于正常对照组(P＜0.05)，且随高糖持续时间延长而逐渐增高。使用胰岛素干预治疗后，DR 模型小鼠视网膜组织中的cPWWP2A 表达量要明显低于未治疗组，但仍高于正常对照组(见图 1.5 A)。在自发性糖尿病模型小鼠即 db/db 小鼠视网膜组织中，cPWWP2A 的表达量也明显高于正常对照组(P＜0.05)，而胰岛素干预治疗组中 cPWWP2A 的表达量较正常对照组明显降低(见图 1.5 B)。

量要明显低于未治疗组，但仍高于正常对照组型小鼠即 db/db 小鼠视网膜组织中，cPWWP2(P＜0.05)，而胰岛素干预治疗组中 cPWWP2(见图 1.5 B)。于视网膜组织中的cPWWP2A运用Sanger法测序的结A 的碱基序列(下列)与 circBase 数据库中序列(上列)
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R587.2;R774.1

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