染料木黄酮调控miRNA-1469发挥促喉癌细胞凋亡作用的分子生物学机制研究

发布时间：2020-05-21 00:33

【摘要】：目的:喉癌是常见的头颈部恶性肿瘤,其中96-98%以上是喉鳞状细胞癌。喉癌具有较强的侵袭与转移性,尽管目前针对喉癌的手术、放化疗以及靶向治疗技术明显进步,但其五年生存率仍约为60.9%,较过去无明显提高。为了提高喉癌患者的生存率,目前寻找治疗喉癌新的治疗靶点和治疗手段有重要意义。染料木黄酮属于大豆异黄酮复合物,它可以通过多种分子生物学机制发挥抗肿瘤作用,包括丝裂原活化蛋白激酶MAPK,Akt以及JAK/STAT等。之前的研究显示,染料木黄酮可以抑制喉癌Hep-2细胞的增殖,然而其抑制喉癌细胞的分子生物学机制仍未见研究报道。MicroRNAs是内源性的小分子非编码RNA,它通过序列特异性来调控基因的表达。这种调控主要是通过与靶基因mRNA的3'端非编码区域结合从而降解mRNA或者抑制mRNA的翻译。研究显示,染料木黄酮可以调控多种肿瘤细胞内miRNA的表达,但是在喉癌细胞中,染料木黄酮对miRNA表达的影响尚未见研究报道。P53基因人类发现的最重要的抑癌基因之一,它可以通过细胞周期阻滞、衰老和促凋亡来抑制肿瘤的发生。研究显示染料木黄酮可以通过抑制P53蛋白的泛素化,上调其在乳腺癌细胞、非小细胞肺癌细胞及宫颈癌细胞中的表达水平,进而发挥抑制肿瘤的作用。而另一方面,研究显示P53蛋白则可以在转录水平和转录后加工水平调控部分miRNA的表达,然而染料木黄酮调控miRNA的表达是否与P53蛋白的作用有关目前未见研究报道。本实验分为三个部分,第一部分为检测喉癌细胞中表达水平受染料木黄酮影响的miRNAs,第二部分研究染料木黄酮调控目标miRNA表达发挥促喉癌细胞凋亡作用的下游靶基因,第三部分研究染料木黄酮上调miRNA表达的分子生物学机制。本实验目的为明确染料木黄酮调控喉癌细胞内miRNA表达的机制,从而阐明染料木黄酮调控miRNA发挥促进喉癌细胞凋亡作用的分子生物学机制,为临床应用染料木黄酮作为抗喉癌治疗药物提供理论与实验依据。研究方法:采用基因芯片分析,检测经染料木黄酮处理后的喉癌细胞中miRNAs表达情况,筛选出表达明显受染料木黄酮影响的miRNA,并检测其对染料木黄酮促凋亡作用的影响。通过基因预测软件TargetScan预测miR-1469的靶基因,并通过westernblot、双荧光素酶基因报告、靶蛋白挽救实验明确其靶向调控关系,最后研究染料木黄酮上调miR-1469表达是否与P53蛋白的作用有关。第一部分:1.通过流式细胞仪检测染料木黄酮对喉癌细胞凋亡的影响。2.将TU212细胞用染料木黄酮处理48h后行芯片分析显示,筛选表达水平明显受染影响的miRNA。3.Real-timePCR证实芯片分析结果。4.建立miR-1469低表达喉癌细胞系,westernblot及流式细胞仪检测染料木黄酮对其凋亡的影响。第二部分:1.通过miRNA靶基因预测软件对miR-1469的靶基因进行预测。2.建立miRNA-1469低表达喉癌细胞系,Westernblot检测染料木黄酮对其Mcl1和Bcl2表达的影响。3.建立miRNA-1469过表达喉癌细胞系,Westernblot检测其Mcl1和Bcl2的表达水平。4.双荧光素酶报告实验明确miR-1469与靶基因的调控关系。5.Westernblot检测染料木黄酮对Mcl1过表达喉癌细胞凋亡的影响。6.Westernblot检测染料木黄酮对miRNA-1469和Mcl1双低表达喉癌细胞凋亡的影响。第三部分:1.Westernblot检测染料木黄酮对喉癌细胞内P53蛋白表达的影响。2.Real-timePCR法检测染料木黄酮对P53低表达喉癌细胞中miR-1469的影响。3.Westernblot检测染料木黄酮对P53低表达喉癌细胞凋亡的影响。4.Westernblot检测染料木黄酮对P53过表达喉癌细胞凋亡的影响。5.Westernblot检测染料木黄酮对P53低表达、miRNA-1469过表达的喉癌细胞的凋亡的影响。6.Westernblot检测染料木黄酮对P53和Mcl1双低表达的喉癌细胞的凋亡的影响。结果:第一部分1.流式细胞仪检测细胞凋亡情况,结果显示随着genistein作用时间的延长,Hep-2与TU212细胞的凋亡率逐渐增加(P0.05)。2.基因芯片分析显示经染料木黄酮处理后TU212细胞中miRNA-1469表达水平明显上调。3.Real-timePCR检测结果显示,结果显示随着genistein作用时间的延长,Hep-2与TU212细胞中miR-1469的表达水平逐步增加(P0.05)。4.Westernblot检测显示,与对照组相比,miR-1469低表达的Hep-2及TU212细胞经染料木黄酮处理后,喉癌细胞凋亡水平明显下降。5.流式细胞仪检测细胞凋亡显示,与对照组相比,miR-1469低表达的TU212细胞经染料木黄酮处理后,细胞凋亡率显著下降(P0.05)。第二部分1.通过miRNA靶基因预测软件TargetScan,我们预测到miR-1469与凋亡抑制基因Bcl2和Mcl1的3'-UTR可能存在结合位点。2.Westernblot检测显示,染料木黄酮可以下调喉癌细胞中Mcl1和Bcl2蛋白的表达,而下调细胞中miR-1469的表达后,Mcl1表达升高,而Bcl2表达仍降低。3.Westernblot检测显示,miR-1469过表达后,与对照组相比,Mcl1蛋白表达降低,而Bcl2蛋白表达无明显改变。4.双荧光素酶报告显示,miR-1469可以与Mcl1的3'-UTR结合。5.Westernblot检测显示,经染料木黄酮处理后,转染空白质粒的Hep2细胞与TU212细胞的凋亡水平升高,而转染Mcl1过表达质粒的Hep2细胞与TU212细胞的凋亡水平降低。6.Westernblot检测显示,经染料木黄酮处理后,与空转对照组相比,单转miR-1469inhibitor组PARP剪切蛋白表达降低,说明其凋亡被抑制,而双转miR-1469inhibitor+Mcl1shRNA组喉癌细胞凋亡水平再次升高。第三部分1.Westernblot检测显示随着染料木黄酮作用时间的延长,喉癌细胞系中P53表达增加。2.Real-timePCR检测显示,与对照组相比,P53低表达TU212和Hep2细胞经染料木黄酮处理后,miR-1469表达水平明显降低(P0.05)。3.Westernblot检测显示,与空转对照组相比,P53低表达的TU212细胞和Hep2细胞经染料木黄酮处理后,喉癌细胞凋亡水平明显降低。4.Westernblot检测显示,经染料木黄酮处理后,与空转对照组相比,转染P53过表达质粒的TU212细胞和Hep2细胞中喉癌细胞凋亡水平升高。5.Westernblot检测显示,经染料木黄酮处理后,与空转对照组相比,单转P53shRNA组喉癌细胞凋亡水平降低,而双转miR-1469mimic+P53shRNA组细胞凋亡水平再次升高。6.Westernblot检测显示,经染料木黄酮处理后,与空转对照组相比,单转P53shRNA组的细胞凋亡水平降低,而双转Mcl1shRNA+P53shRNA组的凋亡水平再次升高。结论:1.染料木黄酮可以上调喉癌细胞中miR-1469的表达。2.miR-1469对喉癌细胞具有促凋亡作用,染料木黄酮通过上调miR-1469表达促进喉癌细胞的凋亡。3.Mcl1是miR-1469的下游靶基因。4.染料木黄酮通过上调miR-1469表达,进而下调Mcl1表达,发挥促进喉癌细胞凋亡作用。5.染料木黄酮可以通过上调P53表达进而上调miR-1469表达。6.染料木黄酮通过上调P53表达进而上调miR-1469的表达,miR-1469通过抑制其下游靶基因Mcl1的表达,从而发挥促进喉癌细胞凋亡的作用。
【图文】：

10图 1.1 流式细胞仪检测染料木黄酮对 hep-2 和 TU212 细胞凋亡的影响图中所示，流式细胞仪检测凋亡显示随着染料木黄酮作用时间的延长，Hep-2 细胞（图 B）与 TU212 细胞（图 C）的凋亡率逐渐增加（P<0.05）。3.2 基因芯片分析显示，，经染料木黄酮处理后，TU212 细胞中 miRNA--1469 表达水平上调最为明显我们将 TU212 细胞用染料木黄酮处理 48h 后行芯片分析显示，与对照组相比miRNA-1469 表达上调最为明显（图 1.2 图 1.3）。

基因芯片分析显示，TU212经染料木黄酮处理后，miRNA-1469表达上调最为明显
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R739.65

【参考文献】

相关期刊论文 前1条

1 ;Apoptosis of human primary gastric carcinoma cells induced by genistein[J];World Journal of Gastroenterology;2004年12期

本文编号：2673450