微生态环境对变应性鼻炎发病及机制的研究

发布时间：2017-03-29 05:14

  本文关键词：微生态环境对变应性鼻炎发病及机制的研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：变应性鼻炎(Allergic rhinitis,AR)又称为过敏性鼻炎,是指具有特异性体质的人接触特定的变应原以后发生的鼻粘膜炎症性疾病,这一病理过程主要是由IgE介导,涉及多种炎症细胞和炎症介质、以及其他多种细胞因子的参与和释放[1]。主要临床表现为鼻痒、喷嚏、清水样涕及眼痒等症状[2]。随着人们生活水平的提高,AR的发病率逐年增加,巨额的治疗费用给家庭和社会都带来了沉重的负担[3]。目前对于AR的治疗以脱敏疗法和对症治疗为主[4],但患者依从性差、症状控制易反复,常可并发哮喘,严重影响着患者的生活质量[2]。因此,有效防治AR意义重大。近期研究发现,变应性疾病在欧美等发达国家的发病率明显高于其他欠发达国家[5],出现这一现象的原因无法单独用种族差异或基因遗传等因素解释[6]。有学者认为,生活环境中微生物多样性的减少可能与某些免疫性疾病和慢性炎症疾病的发病率升高有关[5],如特应性皮炎和克罗恩病[7]。Strachan提出的“卫生学说”认为,由于人类生活环境的逐渐改善和对于自身周围卫生条件越来越重视,导致了人体尤其是儿童时期接触病原微生物的机会大大减少,使得儿童的免疫系统缺乏有效的刺激和调动,由此引发免疫系统对于某些本应属于人体内环境的正常菌群产生过度反应,最终导致变应性疾病发病率的升高[8]。那么AR的发生是否与鼻腔的微生态环境的改变有一定的关联?AR患者鼻腔的微生态环境发生了怎样的改变?鼻腔微生态环境的改变如何引起AR的发病?其机制是什么?为解答以上的问题,我们通过实验研究了微生态环境改变对小鼠AR发病率的影响;应用16S rDNA高通量测序技术对AR患者和正常人鼻腔内的菌群分布进行分析;选择筛选出的差异菌与诱导的人外周血未成熟的树突状细胞共培养探索差异菌对ar的作用及机制。本研究揭示了鼻腔微生态环境与ar之间的关系,对进一步研究ar的防治具有重要意义。本研究分三部分:第一部分探讨微生态环境的改变对小鼠变应性鼻炎(ar)发病率的影响方法:将60只新生的balb/c小鼠随机分为2组,每组30只。一组置于超净无菌环境(germ-free,gf,gf环境组),另一组置于无特定病原体环境(specificpathogen-free,spf,spf环境组)中饲养。2种环境中的小鼠再各分为模型组(20只)和对照组(10只)。2个模型组在6周龄时用卵清蛋白(ova)致敏并激发,观察其症状和体征并评分;于第9周末再次激发后取材,用苏木精-伊红染色法行鼻腔组织切片染色;应用酶联免疫吸附法(elisa法)检测外周血血清中ige、ifn-γ和il-4浓度。结果:各组小鼠症状体征评分显示,gf模型组中ar反应阳性体征的小鼠数量显著高于spf模型组;苏木精-伊红染色显示ar反应阳性小鼠鼻黏膜高度充血水肿,有大量炎性细胞浸润,各模型组中ar反应阴性的小鼠和对照组的小鼠鼻黏膜无异常形态;嗜酸性粒细胞(eos)计数显示ar反应阳性小鼠鼻黏膜内eos明显增多;elisa结果显示ar反应阳性小鼠血清中ige、il-4浓度显著升高(p0.05),ifn-γ浓度显著降低(p0.05)。结论:gf环境中小鼠ar的发病率高于spf环境。第二部分应用16srdna高通量测序技术探索ar患者与正常人群鼻腔微生态菌群的差异方法:在鼻内镜下用无菌咽拭子取8例ar患者及7例正常人鼻腔中鼻道分泌物,提取总的细菌全组dna,行16srdnav6区检测。结果:测序后总共生成1,900.09mb的数据,总共检测的细菌范围覆盖35门、39纲、77目、179科、338属和38种;通过分析对比发现ar患者鼻腔内菌群otu数量(3176±623.6)大于正常人群(1771±397.2);主成分分析显示放线菌目、乳杆菌目和假单胞菌目在ar患者和正常人群鼻腔中的差异性最大;otu分析显示解没食子链球菌、奈瑟菌和噬盐单胞菌在ar患者鼻腔内的数量显著高于正常人群,且均有统计学意义(p0.001);棒状杆菌在ar患者鼻腔内的数量显著低于正常人群,且具有统计学意义(p0.001);两组样本组内比较显示各组内的细菌种类及数量无统计学差异(p0.05)。结论:ar患者与正常人群鼻腔微生态菌群存在显著差异,解没食子链球菌、奈瑟菌和噬盐单胞菌在ar患者鼻腔内的数量显著高于正常人群,假白喉棒状杆菌在ar患者鼻腔内的数量显著低于正常人群,鼻腔菌群失调可能与ar的发生有关。第三部分差异菌与未成熟的树突状细胞共培养探索差异菌对树突状细胞功能的影响本实验通过将第二部分实验中筛选出的ar患者与正常人群鼻腔中存在显著性差异的菌种,即c(corynebacteriumpseudodipheriticum)和s(streptococcusgallolyticus),分别与诱导的人外周血来源的未成熟的树突状细胞共培养后,观察c、s对未成熟的树突状细胞的分化程度的影响。通过对th1/th2平衡因子的研究,探索c和s在ar发病中的分子学机制。方法:本研究分为idcs、c、cs、s和mdcs五组。应用humancd14microbeads分选人外周血pbmc中的cd14+细胞,用未成熟的树突状细胞诱导培养液培养6d,诱导生成未成熟的树突状细胞。idcs组应用完全1640培养液继续培养48h;c、cs和s组分别将灭活的c、cs和s与人外周血诱导的未成熟的树突状细胞共培养48h;mdcs组应用tnf-α培养液培养48h,刺激未成熟的树突状细胞向成熟的树突状细胞转化。应用流式细胞术分别检测五个组中树突状细胞表面共刺激分子cd80和cd86的变化;应用elisa技术检测培养液中il-12的分泌水平;应用场发射扫描电子显微镜观察培养后各组的树突状细胞形态。最后,将以上五组培养后的细胞与cd4+t淋巴细胞以1:20、1:10和1:5的比例共培养48h,应用elisa法检测培养液中ifn-γ和il-4的表达水平;应用mtt法检测cd4+t细胞的增殖情况。结果:流式细胞术检测发现s组中表达cd80和cd86的树突状细胞数量较idcs、c和cs组均显著增高,且有统计学意义(p0.05);但与mdcs组无统计学差异;elisa检测的结果显示,s组培养液中il-12的分泌水平较idcs、c和cs组均降低,且有统计学意义(p0.05);但与mdcs组无统计学差异。场发射扫描电子显微镜观察发现S组的细胞表面与mDCs组均有大量不规则树突样凸起,即典型的成熟状态的树突状细胞。ELISA检测各组细胞与CD4+T细胞共培养后的IFN-γ水平检测,iDCs组C组CS组S组mDCs组,且C组和S组之间差异具有统计学意义(P0.05),各组组内比较无统计学差异;IL-4水平检测iDCs组C组CS组S组mDCs组,且C组和S组之间差异具有统计学意义(P0.05),各组组内比较无统计学差异。MTT结果显示S组较iDCs、C和CS组CD4+T淋巴细胞增殖显著增加,且具有数量依赖关系,当培养后的细胞与CD4+T淋巴细胞以1:5的比例时,CD4+T淋巴细胞的增殖能力最高。结论:Streptococcus gallolyticus可促进未成熟的树突状细胞向成熟的树突状细胞转化,具有刺激CD4+T淋巴细胞增殖的能力;抑制CD4+T淋巴细胞分泌IFN-γ的表达量,促进CD4+T淋巴细胞分泌IL-4的表达量。Corynebacterium pseudodipheriticum可显著抑制Streptococcus gallolyticus诱导的未成熟的树突状细胞向成熟的树突状细胞转化。
【关键词】：变应性鼻炎 微生态环境 16S rDNA 树突状细胞 Streptococcus gallolyticus Corynebacterium pseudodipheriticum CD4+T淋巴细胞
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R765.21
【目录】：

• 缩略语表4-5
• 中文摘要5-9
• Abstract9-14
• 前言14-16
• 文献回顾16-25
• 第一部分 微生态环境对小鼠变应性鼻炎发病率的影响25-34
• 1 材料25-26
• 2 方法26-28
• 3 结果28-31
• 4 讨论31-34
• 第二部分 变应性鼻炎患者鼻腔微生态菌群的研究34-46
• 1 材料34-35
• 2 方法35-38
• 3 结果38-44
• 4 讨论44-46
• 第三部分 差异菌对树突状细胞功能的影响46-67
• 1 材料46-48
• 2 方法48-54
• 3 结果54-64
• 4 讨论64-67
• 小结67-68
• 参考文献68-73
• 个人简历和研究成果73-74
• 致谢74-75

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本文编号：273757