左旋肉碱通过MAPK信号通路抑制人晶状体上皮细胞氧化损伤的实验研究

发布时间：2020-07-23 20:17

【摘要】：目的:氧化应激是导致老年性白内障产生的一个关键因素,人晶状体上皮细胞(HLECs)易受氧化应激的影响,氧化损伤可以使晶状体的混浊,最终引起白内障。众所周知,左旋肉碱(L-carnitine,LC)是人体必须的物质,在体内和体外具备很强的抗氧化能力,广泛分布于不同的生物体内,然而左旋肉碱对于HLECs氧化损伤的保护作用以及机制尚无统一的论断。本研究旨在评估LC对HLECs氧化损伤的影响,而且讨论左旋肉减(LC)对H2O2诱导的HLECs氧化损伤的保护作用及相关机制。方法:将HLE B-3细胞分为以下五组:(1)对照组:在正常培养基中培养。(2)氧化损伤组:除上述培养液外,加入H_2O_(2,)浓度为250μmol/L。(3)LC低浓度组:100μmol/L的LC预处理细胞16h,然后加入250μmol/L的H_2O_2处理24h,(4)LC中浓度组:300μmol/L的LC预处理细胞16h,然后加入250μmol/L的H_2O_2处理24h,(5)LC高浓度组:500μmol/L LC预处理细胞16h,加入250μmol/L的H_2O_2处理24h,所有细胞在用LC和H_2O_2处理前均用无血清的培养基饥饿处理8个小时。在LC预处理和不预处理的情况下,分别用含有过氧化氢(H_2O_2)的培养基培养人晶状体上皮细胞HLE B-3细胞,以探究LC对H_2O_2诱导的HLECs氧化应激的影响。用CCK-8法检测细胞存活率,以评估细胞的增殖变化。按照公式计算,细胞存活率(%)=[(As-Ab)]/[(Ac-Ab)。其中,As是实验组平均OD值,Ab为空白组平均OD值,AC为对照组的平均OD值。通过DCFH-DA染色检测在过氧化氢和LC处理下,氧自由基(ROS)产生的量,以评估HLE B-3细胞的氧化应激状态。通过逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)和蛋白免疫印迹技术(Western-Blot)检测氧化损伤标记物和抗氧化酶的表达水平,并且进一步研究LC对H_2O_2诱导的人晶状体上皮细胞HLE B-3氧化损伤的保护作用及调控机制。结果:1.H_2O_2可显著诱导人晶状体上皮细胞HLE B-3细胞死亡,LC能够显著抑制由H_2O_2引起的人晶状体上皮细胞HLE B-3细胞活力的降低。2.H_2O_2处理组HLE B-3细胞ROS显著增多,但对于LC预处理组的HLE B-3细胞,ROS生成发生了明显的下降。LC通过提高抗氧化酶FoxO1、PRDX4和CAT的表达从而降低ROS的生成。3.LC可以通过抑制Caspase3和IL-1等凋亡相关因子与炎症因子的表达从而抑制过氧化氢诱导的细胞凋亡和炎症反应。4.LC通过促进与增殖相关的因子如PCNA、CDK2、CDK4表达,从而恢复由双氧水诱导的HLECs的增殖损伤。5.HLE B-3细胞中ROS累积可以诱导晶状体上皮细胞发生上皮间质转化(EMT),而经过LC预处理后,能够观察到水通道蛋白(AQP1)和波形蛋白(Vimentin)的表达逆转,从而逆转EMT。6.LC通过MAPK信号通路修复氧化/抗氧化失衡和细胞损伤。结论:LC拥有抑制HLE B-3细胞氧化损伤的保护性作用,或许可以成为一种预防和延缓白内障的药物。
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R776.1
【图文】：

细胞活性,保护作用,预处理,毒性作用

在 LC 预处理 HLE B-3 细胞后，是否会逆转 H2O2对细胞的毒性作用。如图1C 所示，与单独 H2O2组相比，LC 预处理 16 小时后，对 HLE B-3 有显著的保护作用，但其保护作用不是随着药物浓度的提高而提高的。当 LC 浓度为

细胞,预处理,细胞活性,培养细胞

图 1：CCK-8 检测 H2O2和 LC 对 HLEB-3 细胞活性的影响（n=3,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001, ns, no significant differences (P≥0.05)1.2.2 LC 可以逆转由 H2O2诱导的 ROS 的生成。为了研究 LC 在 ROS 诱导的 HLE B-3 细胞氧化损伤中的作用，我们用 LC预处理 HLE B-3 细胞 16 小时后加入 250μmol/ L H2O2继续培养细胞 24 小时。如图 2A 所示，H2O2处理组的 ROS 水平显着高于对照组，但是加入 LC 预处理后，细胞的 ROS 水平显着降低，并以浓度依赖性方式降低。以上结果表明 LC 可以抑制由 H2O2诱导的 HLE B-3 细胞中 ROS 的产生。

实验检测,指标,氧化损伤

天津医科大学硕士学位论文1.2.3 LC 可以促进抗氧化物的产生既然 LC 可以逆转由 H2O2诱导的细胞中 ROS 的产生，那么，其潜在的分子机制变化仍需进一步探究。因此，我们考虑检测在 LC 和 H2O2处理后，HLE B-3细胞中抗氧化物指标水平是否有变化。FoxO1、CAT 和 PRDX4 是有效的抗氧化物。如图 3B 所示，与对照组相比，H2O2组 FoxO1、PRDX4 及 CAT mRNA 表达水平明显降低，说明 H2O2处理可以使 HLE B-3 细胞中抗氧化物水平下降。而与H2O2处理组对比，LC 预处理组显著提高了 Foxo1 基因 mRNA 水平，并且也增加了 PRDX4 和 CAT 的 mRNA 表达。同时， Western-Blot 结果从蛋白水平进一步证实了该结果，与阴性对照组相比，H2O2组 PRDX4 蛋白水平明显下降，说明H2O2可以使细胞内抗氧化物水平降低。而与 H2O2处理组比较，LC 预处理组PRDX4 蛋白表达明显增加（图 3C），这一结果表明 LC 可以通过促进抗氧化物的生成，逆转 H2O2产生的氧化损伤，从而对暴露于氧化损伤的 HLECs 起到一定的保护作用，减少氧化损伤。

【参考文献】