【摘要】：背景:糖尿病视网膜病变(Diabetic retinopathy,DR)系由糖尿病引起的眼部视网膜微血管损伤的一种远期并发症,是全世界失明的最主要原因。同型半胱氨酸(Homocysteine,Hcy)是甲硫氨酸的中间代谢产物,血Hcy高水平会诱发视网膜神经节细胞的凋亡。叶酸参与Hcy的代谢过程,叶酸的吸收、代谢障碍可影响同型半胱氨酸甲基化为甲硫氨酸,从而导致同型半胱氨酸累积,补充叶酸治疗后可显著降低循环中Hcy的水平。有研究表明Hcy和糖尿病视网膜病变之间存在关联,但结果是互相矛盾的。补充叶酸治疗来降低或者延缓DR发生的机理尚不清楚。目的:(1)研究高同型半胱氨酸血症与糖尿病视网膜病变之间的关系。(2)研究叶酸减轻糖尿病小鼠眼球局部的炎性反应、降低视网膜病变风险的保护性作用及机制。(3)探究叶酸联合二甲双胍在糖尿病小鼠中的应用,在降低血糖浓度的同时降低视网膜病变的风险。(4)探究口服叶酸在糖尿病患者视网膜病变的保护作用。方法:(1)同型半胱氨酸对糖尿病视网膜病变影响的系统评价和Meta分析:通过检索中国知网、万方数据、PubMed、Cochrane library和EMBASE数据库,检索时间均为自数据库建立起至2017年11月为止。按预先制定的纳入与排除标准,对于符合标准的文献,由2位评价员严格按照纳入标准独立筛选、提取资料,并进行偏倚风险评估后,使用STATA软件进行Meta分析,采用GRADE profiler3.6软件评价证据质量,进行质量等级分级。用固定效应模型或随机效应模型合并比值比(OR)值及95%可信区间(CI)分析同型半胱氨酸和糖尿病视网膜病变风险之间的关系并进行亚组分析,采用敏感性分析评估结果的稳定性,用漏斗图评估文献的发表偏倚。(2)叶酸对小鼠视网膜病变的保护作用及其机制:(1)糖尿病小鼠的饲养、血糖和体重的测定:7周龄SPF级2型糖尿病模型小鼠(db/db小鼠)60只和同周龄的健康C57BL/KsJ(WT)小鼠15只。每周检测一次空腹血糖,同时每日监测小鼠的体重变化情况,直至实验结束。数据均以均数±标准差(Mean±SD)表示,并在SPSS软件(20.0)中进行统计学分析,设P≤0.05具有统计学意义。(2)叶酸对2型糖尿病小鼠的视网膜病变的保护性作用:将60只db/db小鼠随机分为四组:叶酸组15只、阴性对照组15只、二甲双胍组15只、二甲双胍联合叶酸组15只。另外15只正常C57BL/Ks小鼠作为空白对照组。叶酸组小鼠每日以71μg/kg的叶酸溶液100μl灌胃,二甲双胍组每日以120 mg/kg的二甲双胍溶液100μl灌胃,二甲双胍联合叶酸组每日以71μg/kg的叶酸溶液100μl和120 mg/kg的二甲双胍溶液100μl灌胃,阴性对照组和健康空白对照组以等体积的生理盐水灌胃,连续给药4周。每周检测一次空腹血糖,每日监控小鼠体重变化。4周给药周期结束后,每只小鼠在处死前行光学相干断层扫描(OCT)和眼底镜检查。处死小鼠,摘除眼球后取血,用ELISA检测胰岛素、同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)、白介素IL-1β(interleukin 1 beta,IL-1β)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)水平。取视网膜组织,通过q-PCR检测视网膜组织Il-1β基因和vegf基因的相对表达量;用WB检测视网膜组织NOX4和VAV2的蛋白表达量。HE染色观察黄斑视网膜厚度;通过免疫组化(immunohistochemistry,IHC)和免疫荧光技术(immunofluorescence,IF)检测视网膜组织上CD31、VEGFR、3-NT、4-HNE、NLRP3等细胞因子的表达量。所有定量数据均以均数±标准差(Mean±SD)表示,并在SPSS软件(20.0)中进行统计学分析,设P≤0.05具有统计学意义。(3)叶酸对非增殖性糖尿病患者视网膜病变保护作用的研究:选取2017年5月至2017年11月就诊于兰州大学第一医院眼科的30名2型糖尿病非增殖性视网膜病变患者作为研究对象,采用前瞻性临床随机对照实验的研究方法。15名患者纳入对照组,每日接受1.0g二甲双胍降糖治疗;另外15名患者纳入联合治疗组,在服用二甲双胍基础上每日加服5mg叶酸。经过半年治疗后,观察两组患者血叶酸浓度、血同型半胱氨酸、空腹血糖、空腹胰岛素、糖化血红蛋白、视网膜出血点数量、黄斑视网膜厚度(μm)等指标的变化。定量数据均以均数±标准差(Mean±SD)表示,并在SPSS软件(20.0)中进行统计学分析,设P≤0.05具有统计学意义。结果:(1)共纳入11篇研究,总计2184例糖尿病患者。Meta分析结果显示:糖尿病患者同型半胱氨酸水平升高与糖尿病视网膜病变风险增高有关(OR:1.62;95%CI:1.29-2.03;P0.001)。尽管在所纳入的研究中发现了显著的异质性,但敏感性分析的结果仍然具有统计学意义。亚组分析发现同型半胱氨酸和糖尿病视网膜病变在大多数亚群之间有显著的关联,但如果样本量100,参与者有1型糖尿病或研究质量较低,则两者没有显著关联。(2)db/db小鼠的平均体重为42.6±3.41g,同周龄的健康小鼠平均体重为16.1±0.63g。糖尿病小鼠的平均空腹血糖浓度为21.0±1.3mmol/L,而健康小鼠的平均空腹血糖浓度为6.5±0.6mmol/L。(3)研究期间,叶酸组和阴性对照组小鼠的FBG(Fasting blood-glucose)和HbA1c(Haemoglobin A1c)浓度增加。在研究结束前,叶酸组的FBG和HbA1c分别达到28.2±1.4mmol/L和192.64±33.29ng/mL;阴性对照组的FBG和HbA1c分别为26.6±1.7mmol/L和226.44±32.13 ng/mL;而二甲双胍组和联合治疗组的FBG和HbA1c浓度均下降且显著低于叶酸组和阴性对照组(P0.05),二甲双胍组FBG和HbA1c分别为18.7±1.5 mmol/L和171.05±22.81 ng/mL,联合治疗组FBG和HbA1c分别为19.8±1.4 mmol/L和151.42±22.91 ng/mL。二甲双胍组和联合治疗组的小鼠空腹胰岛素浓度也低于叶酸组和阴性对照组(P0.05)。空白对照组为健康小鼠,FBG、HbA1c和空腹胰岛素浓度均低于其他四组。(4)叶酸组小鼠血浆Hcy为7.35±1.18μmol/L,明显低于对照组(阴性对照组为10.39±0.90μmol/L,联合治疗组为7.88±0.93μmol/L,二甲双胍组为11.02±1.13μmol/L(P0.05)),但高于空白对照组(6.75±0.98μmol/L)。此外,ELISA、q-PCR、WB、IHC和IF等检测结果表明4组db/db小鼠的IL-1β、VEGF、Il-1β基因、vegf基因、NOX4、VAV2、CD31、VEGFR、3-NT、4-HNE、NLRP3和其他细胞因子的表达水平高于空白对照组小鼠。这些细胞因子在阴性对照组视网膜组织中的表达显著高于叶酸和空白组(P0.05);二甲双胍组的各种炎症因子的表达量显著高于联合治疗组(P0.05)。治疗结束后,OCT结果和视网膜组织病理学分析显示空白组平均视网膜厚度最高(145.01±15.54μm),其次是联合治疗组(119.39±1.34μm),阴性对照组(104.59±2.09μm)和二甲双胍组(91.77±7.52μm)。但是,眼底镜检查发现每组的眼底结构没有显著改变。(5)临床研究中,二甲双胍组(8.42±4.08 ng/mL)和联合治疗组(8.22±4.23 ng/mL)血清叶酸浓度基线值无显著性差异。研究结束时,联合治疗组血清叶酸浓度(12.15±5.46 ng/mL)显著高于二甲双胍组(7.42±2.88 ng/mL)(P0.05)。联合治疗组的同型半胱氨酸浓度(8.15±2.21μmol/L)低于二甲双胍组(12.16±2.34μmol/L)(P0.05)。联合治疗组空腹胰岛素水平显著升高(P0.05),从11.21±3.02mU/L升高至13.76±3.68mU/L,而HbA1c显著降低,从6.01±1.36%降至4.61±1.25%(P0.05)。而二甲双胍组空腹胰岛素和HbA1c水平差异无统计学意义(P0.05),分别由12.07±5.64mU/L变为11.67±3.76mU/L,5.85±1.26%变为5.79±1.50%。治疗结束时联合治疗组和二甲双胍组之间空腹胰岛素浓度和HbA1c无差异。OCT检查显示两组黄斑视网膜厚度基线无显著差异。在研究结束时,联合治疗组黄斑视网膜厚度为174.13±13.66μm,薄于二甲双胍组(189.73±22.54μm)。虽然在研究之前或研究结束时两组之间视网膜出血点的数量没有显著差异。结论:(1)本研究的结果表明,同型半胱氨酸水平升高与糖尿病视网膜病变的风险增加有关,特别是在2型糖尿病患者中。这一发现可能有助于糖尿病患者制定有效的管理策略,以预防糖尿病视网膜病变的进展。(2)糖尿病模型小鼠的成功饲养为后续研究提供了稳定可靠的动物模型。(3)叶酸可降低血液中同型半胱氨酸的浓度,从而降低视网膜组织中NOX4,VAV2,CD31,VEGFR,3-NT,4-HNE等炎症因子的水平。这些也导致炎症反应、氧化应激和视网膜血管生成的减少,实现了对糖尿病视网膜病变的保护作用,而且这种保护作用也不依赖于降糖治疗。(4)叶酸可能促进2型糖尿病患者的胰岛素分泌,并具有与二甲双胍协同降低血糖的作用。叶酸还可以降低2型糖尿病患者的同型半胱氨酸浓度,减少视网膜炎症反应和视网膜水肿。
【学位授予单位】：兰州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R587.2;R774.1
【图文】：
5图 1-1 “叶酸在糖尿病视网膜病变中的保护作用及机制研究”基础路线图Fig.1-1 The process of protective effect and mechanism of folate in diabetic retinopathy
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