干扰素调节因子3（IRF3）缺失对视网膜的促老化作用及机制研究

发布时间：2020-08-19 12:35

【摘要】：背景:视网膜是一个极易受到年龄因素影响的器官组织,往往会随着年龄增高出现结构改变和功能退化。而且,视网膜的老化与许多年龄相关性视网膜疾病的发生密切相关,例如AMD、glaucoma、视网膜中央静脉阻塞、高血压动脉硬化眼底病等。这些疾病严重影响了人们的视觉质量,甚至导致失明。因此,为了延缓视网膜的衰老,改善视网膜功能,减少视网膜年龄相关疾病的发生,近年来,人们努力探索影响视网膜衰老的各种因素。但视网膜老化的机制仍然不清楚,而且视网膜年龄相关疾病的发生率也在不断增高。干扰素调节因子3(Interferon Regulatory Factor 3,IRF3)是参与抗病毒反应的核心转录因子。当病毒感染宿主时,IRF3会活化并进入细胞核诱导大量Ⅰ型干扰素的产生,从而抵抗病毒感染。近几年来,随着研究的不断深入,IRF3相关的细胞信号转导与调控机制等方面取得重大进展。研究发现,除抗病毒作用之外,IRF3还可以在多种刺激条件下激活,例如DNA损伤,应激诱导因素、生长因子、细胞因子刺激等,从而发挥响应DNA损伤,调控细胞生长,抗肿瘤等重要作用。有研究证实,在病理因素干预条件下,IRF3还可以参与某些视网膜老化相关疾病的病理变化过程。以上研究提示,IRF3可能在视网膜老化的过程中扮演了非常重要的角色,但其具体的作用仍然缺乏相关证据。目的:通过对正常WT和Irf3~(-/-)鼠的对比研究,观察在IRF3缺失条件下,视网膜老化相关的结构和功能改变,并通过G10(IRF3激动剂)进行干预,从而探索IRF3对视网膜老化的作用和机制,为延缓视网膜衰老,减少视网膜老化相关疾病的发生提供新的思路和研究方向。方法:在体条件下,将以C57/BL6为背景的WT和Irf3~(-/-)鼠按照YA(Young adult)和Old两个年龄段分为YA WT、YA Irf3~(-/-)、Old WT、Old Irf3~(-/-)共4个组,YA年龄为2~4个月,Old年龄为22~24个月。分别用S-OCT、HE染色、免疫荧光染色、电镜技术、ERG对IRF3缺失后的小鼠视网膜结构和功能改变进行评价。再结合Western blot、SA-β-gal染色对视网膜在IRF3缺失后的衰老状态进行评价。利用Western blotting对引起视网膜变化的分子机制进行研究。体外条件下,分别建立WT和Irf3~(-/-)鼠的原代RGC细胞缺氧衰退模型,并利用G10(IRF3激动剂)进行干预观察。将WT和Irf3~(-/-)鼠的新生鼠RGC细胞分为WT+vehicle、Irf3~(-/-)+vehicle、WT+H_2O_2、Irf3~(-/-)+H_2O_2、WT+H_2O_2+G10、Irf3~(-/-)+H_2O_2+G10共6个组。分别用Western bloting、SA-β-gal染色对比分析IRF3的表达、老化相关标记蛋白和SA-β-gal染色的表达,并对相关作用的分子机制进行研究。由于Irf3~(-/-)鼠在自然环境中易受病毒感染影响,为排除IRF3介导的炎性反应作用,将HSV-1病毒直接感染WT和Irf3~(-/-)鼠角膜(模拟自然环境),再用流式细胞分选、免疫荧光染色、WB等技术分析视网膜和角膜改变,以及全身炎症反应。结果:1.由Western blotting检测发现,Old(老年)WT组的正常IRF3蛋白表达量比YA(年轻)WT组显著降低(P0.05)。通过ERG检查发现,Irf3~(-/-)鼠的电生理功能比相同年龄段WT鼠明显下降(P0.05)。进一步用S-OCT、HE染色检测视网膜结构显示,Irf3~(-/-)鼠的视网膜厚度比相同年龄段WT鼠显著减少(P0.05),并且以OPL层变化最为明显。利用免疫荧光染色法对视网膜OPL层的突触相关蛋白(Bassoon、PSD-95、Pkcα、Calbindin)进行染色发现,Irf3~(-/-)鼠的视网膜OPL层突触密度比相同年龄段WT鼠有明显异位表现(P0.05)。同时,OPL层的电镜结果提示Irf3~(-/-)鼠的视网膜OPL层突触密度比相同年龄段WT鼠显著降低(P0.05)。2.通过对视网膜的Western blotting检测发现,Irf3~(-/-)鼠的衰老相关蛋白(P53、P16~(INK4a)、PML、P-H2A.X、IREα)表达量比相同年龄段WT鼠显著增高(P0.05)。并且,SA-β-gal染色也提示,Irf3~(-/-)鼠的视网膜比相同年龄段WT鼠有更明显的阳性染色变化(P0.05)。对大量相关分子进行WB检测后发现,Erk通路蛋白在Irf3~(-/-)组小鼠中的表达量异常增高(P0.05)。3.通过SA-β-gal染色检测衰老细胞,我们发现Irf3~(-/-)+vehicle组比WT+vehicle组阳性染色细胞数增多(P0.05)。经过H_2O_2处理后,WT和Irf3~(-/-)原代RGC细胞均比未处理组明显增多,且Irf3~(-/-)组增多更为显著(P0.05)。继续使用G10分别处理WT+H_2O_2、Irf3~(-/-)+H_2O_2后,我们发现G10可以明显减少H_2O_2对WT RGC细胞的衰退效应,但对Irf3~(-/-)RGC细胞的衰退效应没有明显影响。Western blotting检测RGC细胞IRF3蛋白、衰老相关蛋白、Erk蛋白提示,Irf3~(-/-)组比WT组有明显神经衰退表现,G10不能明显缓解,与SA-β-gal染色结果一致。4.细胞流式、免疫荧光染色、WB结果提示,受病毒角膜感染后,Irf3~(-/-)鼠与WT鼠相比更易引发全身感染,角膜也易出现明显病变,但在正常SPF饲养条件下,两组均未见明显全身炎症反应差异(P0.05)。同时,Irf3~(-/-)+HSV-1组与Irf3~(-/-)组视网膜突触形态、衰老相关蛋白未见明显差异(P0.05)。结论:本研究表明IRF3的缺失可以促进小鼠视网膜老化相关改变,引起视网膜结构和功能的相关变化。同时,IRF3激动剂G10的使用能够一定程度上延缓视网膜衰老进程。另外,IRF3缺失导致的Erk通路激活可能是影响视网膜老化相关改变的潜在机制。
【学位授予单位】：中国人民解放军陆军军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R774.1
【图文】：

不同年龄,位置,视网膜,小鼠

21A、B: Western blot 检测不同年龄 WT 鼠中的 IRF3 相对表达量，GAPDH 为内参C: IRF3 在年轻和老年 WT 鼠视网膜中的荧光表达比较；D: IRF3(红色)、PKCα(绿色色)在视网膜中表达的位置关系（n=3）；图 1-1 IRF3 在视网膜的表达位置和不同年龄的表达量变化2.3.2 IRF3 缺失会导致小鼠视网膜 ERG 功能的下降。ERG 是目前检查视网膜电生理功能的有效手段。由于上述实验提示随着年龄改变对视网膜有影响，我们进一步应用 ERG 对 IRF3 缺失小鼠和鼠的视网膜生理功能进行检查比较。通过对同年龄段比较发现，Irf3-/-鼠的波幅明显下降，有统计学差异(**P < 0.01, n=6)（图 1-2 A，B）。同时，O波和 b 波波幅也明显低于 YAWT 组(**P < 0.01, n=6)（图 1-2 A，B）。提可能引起小鼠 ERG 生理功能明显下降。

局部放大图,厚度测量,网膜,HE染色

23A、B: OCT 测量小鼠视网膜厚度。A 图中绿色方框为视网膜测量区域，红线为视网膜厚度 IML与 BM 膜；B: A 图中各组视网膜测量的局部放大图进行对比；C: OCT 测量数据量化统计（***P <0.001, n=6）； D: HE 染色测量各组视网膜厚度，每组放大图为对应组黄色方框内区域。E:视网膜总厚度以及各层厚度量化分析（* P > 0.01，** P > 0.01, ***P < 0.001, n=6）。图 1-3 OCT 和 HE 染色对视网膜厚度测量2.3.4 IRF3 缺失导致小鼠视网膜 OPL 层突触异位以及 OPL 层突触密度减少。研究表明，视网膜 OPL 层是光感受器细胞和中间神经元形成突触的特定视网膜层。通过上述实验结果提示，Irf3-/-组小鼠视网膜厚度的改变以 OPL 层最为明显，并且 IRF3

蛋白表达,视网膜,小鼠,信号通路

3.3 结果3.3.1 IRF3 缺失引起 Erk 通路激活。近年来，IRF3 对衰老的调节作用得到了关注，但在视网膜的相关作用和机制仍然不明确。有研究表明，Erk 通路可以受 IRF3 下游 IFN-β调节发挥作用[55]，同时，Erk通路可以参与机体衰老的相关机制。在我们的研究中发现，与同年龄 WT 鼠相比，IRF3的缺失可以导致 Erk 信号通路蛋白显著激活。包括 p-MEK1/2、P-44/42、p-P44/42、p-P90RSK 蛋白分子。而且，正常生理状态下，Old WT 鼠与 YAWT 鼠相比，Erk 信号通路蛋白表达也明显增高(*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，n=6)（图 2-1 A，B）。通过对 p-MEK1/2 的荧光染色，我们可以进一步发现，不仅 p-MEK1/2 的表达趋势与WB 结果相一致，而且其表达位置也与 IRF3 位置相近，同样位于 OPL 层，(**P < 0.01，***P < 0.001，n=5)（图 2-1 C，D）。

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