关于RAGE-配体系统在慢性间歇性低氧致动脉粥样硬化机制中的作用的初期体外研究

发布时间：2017-04-01 17:10

  本文关键词：关于RAGE-配体系统在慢性间歇性低氧致动脉粥样硬化机制中的作用的初期体外研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征(OSAHS)是导致动脉粥样硬化(AS)的重要原因之一,但关于其具体作用机制目前尚未阐明。而OSAHS的典型病理特征表现为慢性间歇性低氧(IH),其可能是OSAHS导致AS的关键因素。多项研究指出,RAGE-配体系统在动脉粥样硬化的发病机制中起着非常重要的作用,而IH能够激活AGEs/RAGE系统。因此,本研究拟基于RAGE-配体系统,探讨慢性IH导致AS的相关机制。首先,在体外实验中,使用RNAi沉默目的基因RAGE,检测IH对THP-1源性巨噬细胞的转化、泡沫细胞的形成及胆固醇运输蛋白的调节等方面的影响。实验初期主要完成如下两项:一是通过优化PMA诱导分化THP-1细胞的条件,成功诱导出THP-1源性巨噬细胞,建立巨噬细胞实验模型,用于后续AS致病机制的观察。二是构建并筛选出最佳sh RNA/RAGE慢病毒载体并感染THP-1细胞,以期到达沉默THP-1细胞RAGE基因效果,便于用于后续实验分组。方法:体外培养THP-1细胞;PMA诱导THP-1细胞分化为THP-1源性巨噬细胞,通过形态学观察和流式细胞术检测CD14、CD68阳性率,鉴定其诱导分化程度;构建sh RNA/RAGE慢病毒载体;sh RNA/RAGE慢病毒载体感染THP-1细胞,RTQ-PCR及Western-blot鉴定RAGE在THP-1细胞中的沉默情况;结果:1、流式细胞术测定诱导分化前后细胞表面标记物CD14、CD68的百分率,诱导前分别为3.5%、1.3%,诱导后表面标志物明显升高,分别为37.7%、46.8%,差异有统计学意义(P0.01),实验结果提示成功诱导出THP-1源性巨噬细胞。2、成功构建sh RNA/RAGE慢病毒载体,RT-PCR结果显示,KD1、KD2、KD3组sh RNA/RAGE慢病毒载体对RAGE基因的抑制效果均不明显,抑制率分别为47.8%、30.2%与29.4%;Western-blot结果显示,KD1、KD2、KD3组慢病毒载体对RAGE蛋白表达抑制效果不佳,抑制率分别为41.2%、14.9%与11。3%,提示KD1、KD2、KD3组sh RNA/RAGE慢病毒载体均未能成功产生基因沉默效果,不可用于后续实验,需重新设计sh RNA/RAGE慢病毒载体或者使用其他方法阻断RAGE—配体信号通路。结论:1、PMA成功诱导出THP-1源性巨噬细胞,成功建立巨噬细胞实验模型。2、成功构建了sh RNA/RAGE慢病毒载体,KD1、KD2、KD3组sh RNA/RAGE慢病毒载体均可成功感染THP-1细胞但均未能产生有效的基因沉默效果,需要进一步摸索沉默RAGE基因的相关实验方法。
【关键词】：晚期糖基化终末产物受体 RNA干扰 人单核细胞白血病细胞 佛波酯
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R766;R543.5
【目录】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-9
• 中英文略缩词表9-11
• 第1章 前言11-13
• 第2章 材料与方法13-28
• 2.1 实验对象13
• 2.2 主要实验设备、试剂及其配置13-18
• 2.2.1 主要实验设备13-14
• 2.2.2 主要试剂及配置14-18
• 2.3 主要方法与步骤18-27
• 2.3.1 THP-1 细胞培养19-20
• 2.3.2 THP-1 细胞诱导分化20
• 2.3.3 流式细胞术对PMA诱导分化后的THP-1 源性巨噬细胞的鉴定20-21
• 2.3.4 sh RNA/RAGE 慢病毒载体构建及细胞感染21-24
• 2.3.5 RTQ-PCR检测RAGE基因沉默效果24-26
• 2.3.6 Western blot检测RAGE蛋白表达率26-27
• 2.4 统计学处理27-28
• 第3章 结果28-36
• 3.1 PMA对THP-1 细胞诱导分化形态学观察28-29
• 3.1.1 正常THP-1 细胞及THP-1 源性巨噬细胞28
• 3.1.2 PMA不同诱导时间及浓度下THP-1 形态变化28-29
• 3.2 THP-1 源性巨噬细胞流式鉴定29-30
• 3.3 shRNA/RAGE慢病毒载体的构建结果30-32
• 3.4 shRNA/RAGE慢病毒载体细胞感染THP-132-33
• 3.5 shRNA/RAGE慢病毒载体感染THP-1 后对RAGE沉默情况33-36
• 3.5.1 RTQ-PCR结果33-34
• 3.5.2 Western-blot结果34-36
• 第4章 讨论36-42
• 4.1 关于THP-1 诱导的分化36-38
• 4.2 RNA干扰方法选择与应用38-40
• 4.3 RAGE、OSAHS与AS相互关系40-42
• 第5章 结论与展望42-43
• 5.1 结论42
• 5.2 展望42-43
• 致谢43-44
• 参考文献44-47
• 综述47-55
• 参考文献52-55

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 吴海霞;张维铭;李晓眠;;基因转染技术的发展与现状[J];国际生物医学工程杂志;2007年06期

  本文关键词：关于RAGE-配体系统在慢性间歇性低氧致动脉粥样硬化机制中的作用的初期体外研究，由笔耕文化传播整理发布。

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本文编号：280979