溴芬酸钠抑制TGF-β1介导的人翼状胬肉成纤维细胞和人结膜成纤维细胞纤维化的研究

发布时间：2020-09-02 15:56

　　 背景与目的翼状胬肉是临床上常见的眼表疾病,是结膜处增生的良性纤维结缔组织及血管,可发展到侵及角膜,其病因不明,多数学者认为该疾病与各种慢性炎症刺激有关,如紫外线照射、沙尘刺激等引起。其主要的病理机制是在慢性炎症刺激下,翼状胬肉前体细胞在活化或升高的细胞因子等作用下发生细胞增殖、迁移、祖细胞上皮向间充质转分化、肌成纤维细胞的激活等。研究发现转化生长因子-β1(transforming growth factor-β 1,TGF-β 1)是在翼状胬肉组织中高表达的一种重要的炎症因子,被认为和翼状胬肉的形成有关。翼状胬肉术后,创伤过度修复造成的病理性纤维化,会导致翼状胬肉的复发。研究表明,非甾体类抗炎药(Non-Steroidal Anti-inflammatory Drugs,NSAIDs)能够减轻炎症反应、逆转上皮间充质细胞转分化、抑制肌成纤维细胞的激活等纤维化过程,能有效降低乳腺癌等纤维化疾病的复发率。另外,研究发现,对比于匹配的结膜组织,环氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)在翼状胬肉组织中明显高表达,COX-2抑制剂在体外模拟实验中可以有效抑制翼状胬肉细胞增殖,但其对翼状胬肉细胞的抗纤维化作用及其分子机制仍不明确。因此本学位论文旨在通过体外培养的人原代翼状胬肉成纤维细胞(human pterygium fibroblasts,HPFs)及人结膜成纤维细胞(human conjunctival fibroblasts,HConFs)模型,探究TGF-β1对HPFs及HConFs的细胞外基质生成、肌成纤维细胞激活、细胞迁移及增殖的诱导作用,以及非甾体类抗炎药溴芬酸钠(bromfenac)对TGF-β1诱导的细胞外基质生成、肌成纤维细胞激活、细胞迁移及增殖的作用及其可能的机制。方法首先,将体外培养的HPFs和HConFs细胞分别分为5组,即20 ng/ml TGF-β1刺激(4组)和无TGF-β1刺激的对照组(1组),在TGF-β1刺激6h,12h,24h,48h后,用Western Blot检测间充质标志物纤连蛋白(fibronectin,FN),Ⅲ型胶原蛋白(collagen 3,COL3)以及α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)的蛋白表达水平,另外,在刺激15min,30min,1 h,2h,6h后,同样用Western Blot检测相关信号分子磷酸化水平及其本底蛋白表达水平,包括:AKT,ERK1/2,GSK-3β-S9,smad2/3,p38 MAPK。为研究溴芬酸钠对TGF-β1诱导的细胞外基质生成、肌成纤维细胞激活、细胞迁移及增殖的可能的抑制作用,将HPFs及HConFs细胞分别分成4组,即:对照组;20 ng/ml TGF-β 1处理组;20 ng/ml TGF-β 1+90ug/ml溴芬酸钠同时处理组;90ug/ml溴芬酸钠处理组。各组HPFs及HConFs细胞同时处理48h,然后用Western Blot及免疫荧光检测细胞FN,COL3和α-SMA蛋白表达水平及分布的改变,同样用Western Blot检测相关信号分子的改变,用划线实验检测细胞迁移能力,通过CCK-8实验检测细胞增殖能力。为进一步证明单用溴芬酸钠可能的抑制细胞外基质生成、肌成纤维细胞激活、细胞迁移及增殖的相关标志物的作用,用3种不同浓度溴芬酸钠(即:30ug/ml,60ug/ml,90ug/ml)梯度处理HPFs和HConFs细胞,处理48h后对比无溴芬酸钠刺激的对照组,通过Western Blot及实时定量PCR检测FN,COL3,基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase 3,MMP3),α-SMA 和 survivin 表达水平的变化,同样用Western Blot检测相关信号分子的改变。为进一步探索溴芬酸钠抑制TGF-β1介导的细胞外基质生成和肌成纤维细胞激活的具体机制,用PI3K抑制剂wortmannin,MEK抑制剂U0126以及GSK-3β抑制剂LiCl和SB216763分别作用于TGF-β1刺激的HPFs及HConFs细胞,以期研究AKT,ERK1/2和GSK-3β信号分子对HPFs及HConFs细胞的细胞外基质生成和肌成纤维细胞激活的影响。用Western Blot检测细胞FN,COL3及α-SMA蛋白表达水平的变化,同样用Western Blot检测相关信号分子的改变。结果TGF-β1暴露48h可以诱导HPFs及HConFs细胞中FN,COL3及α-SMA蛋白表达升高,并促进细胞迁移及增殖。同时加入溴芬酸钠处理可以抑制TGF-β1诱导的FN,COL3及α-SMA蛋白表达升高、细胞迁移及增殖。TGF-β1 通过快速磷酸化 AKT,ERK1/2,GSK-3β-S9,smad2/3,p38 MAPK 等信号分子,从而促进HPFs及HConFs细胞纤维化,其中TGF-β1诱导的p-AKT,p-ERK1/2,p-GSK-3β-S9的水平受到溴芬酸钠的抑制。另外,单用溴芬酸钠处理HPFs及HConFs细胞,不仅在蛋白水平和mRNA水平都抑制了 FN,COL3,α-SMA及survivin的表达,也抑制了信号分子p-AKT,p-ERK1/2,p-GSK-3β-S9的水平。用抑制剂阻断PI3K/AKT通路(wortmannin),MEK/ERK通路(U0126)或者GSK-3β通路(LiCl或者SB216763)均可以抑制TGF-β1诱导的FN,COL3及α-SMA的表达。使用LiCl失活GSK-3β能够升高p-GSK-3β-S9的水平,但并不能逆转溴芬酸钠对FN,COL3及α-SMA蛋白表达的抑制,相反,用LiC1升高p-GSK-3β-S9的水平伴随着FN,COL3及α-SMA蛋白表达水平的降低。结论溴芬酸钠能够抑制TGF-β1诱导的HPFs及HConFs细胞的胞外基质生成、肌成纤维细胞激活、细胞迁移及增殖。溴芬酸钠通过影响AKT和ERK1/2通路,抑制TGF-β1诱导的细胞外基质生成和肌成纤维细胞激活。而用LiCl或者SB216763抑制GSK-3β的活性,能够抑制TGF-βl诱导的HPFs及HConFs细胞的胞外基质生成、肌成纤维细胞激活。
【学位单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R777.33
【部分图文】：

位论文逦正文第一部分第１节原代ＨＰＦｓ和ＨＣｏｎＦｓ细胞的提取ｓ，ＨＣｏｎＦｓ，邋ＨＣｏｎＥｓ，邋ＨＦＦｓ，邋Ｈｅｌａ邋五种细胞的形态鉴定逡逑微镜下形态观察显示，ＨＦＦｓ，邋ＨＰＦｓ和ＨＣｏｎＦｓ细胞都呈典细胞形态，？而Ｈｅｌａ和ＨＣｏｎＥｓ细胞则呈典型的多边形扁平

正文第…部分第１节原代ＨＰＦｓ和ＨＣｏｎＦｓ细胞的提取、培养及鉴定逡逑究枿机选取３个病人的ＨＰＦｓ和３个眼球捐赠者的ＨＣｏｎＦｓ进行ｗｅｓｔｅｒｎ实验鉴定逡逑（图１．２），实验结果显示，ＨＦＦｓ，邋ＨＰＦｓ和ＨＣｏｎＦｓ细胞都明显表达ＦＮ和ＣＯＬ３；逡逑而Ｈｅｌａ细胞的ＦＮ和ＣＯＬ３蛋白的表达为阴性。ＨＦＦｓ，ＨＰＦｓ和ＨＣｏｎＦｓ细胞都高逡逑水平表达ｖｉｍｅｎｔｉｎ邋（用２个不同货号的产品进行验证）；而Ｈｅｌａ细胞的ｖｉｍｅｎｔｉｎ表逡逑达水平较低。对于上皮细胞标志ｐａｎ－ｋｅｒａｔｉｎ蛋白，Ｈｅｌａ细胞表达高水平ｐａｎ－ｋｅｒａｔｉｎ；逡逑而ＨＦＦｓ，邋ＨＰＦｓ和ＨＣｏｎＦｓ细胞基本不表达ｐａｎ－ｋｅｒａｔｉｎ蛋白。逡逑－Ｖ５邋爷邋￣逡逑／邋／邋／邋／邋／邋／邋／邋／逡逑Ｃ0Ｌ３逡逑ｖｉｍｅｎｔｉｎ逡逑（２２0３ｉ）丨r>＊逡逑ｖｉｍｅｎｔｉｎ逡逑（１０３６６）丨U五义希穑幔睿�ｋｅｒａｔｉｎ逡逑ｇａｐｄｈ邋■ｍｊｊｐｕＨｐｐｊｐｊｍｉ逡逑图１．２．邋ｗｅｓｔｅｒｎ实验检测ＨＦＦｓ，邋Ｈｅｌａ细胞以及随机选取的ＨＰＦｓ和ＨＣｏｎＦｓ细胞中逡逑ＦＮ，邋ＣＯＬ３，邋ｖｉｍｅｎｔｉｎ邋和邋ｐａｎ－ｋｅｒａｔｉｎ邋蛋白表徸水平。逡逑图注：上方细胞后跟编号为病人或者眼球捐赠者的序号，左侧ｖｉｍｅｎｔｉｎ后跟括逡逑号内编号为抗体货号。逡逑２．４对ＨＰＦｓ，邋ＨＣｏｎＦｓ，邋ＨＦＦｓ，邋Ｈｅｌａ四种细胞ｍａｒｋｅｒ的细胞免疫荧光鉴定逡逑ＨＦＦｓ作为阳性对照（标准纤维细胞�

本文编号：2810804