Cav1.3钙离子通道蛋白和LaminB1核纤层蛋白在大鼠耳蜗发育阶段的表达及作用

发布时间：2020-10-30 13:13

　　 第一部分:新生SD大鼠耳蜗血管纹边缘细胞原代培养及Cav1.3、LaminB1蛋白的表达目的:建立新生大鼠耳蜗血管纹边缘细胞(MCs)体外培养体系,探讨Cav1.3钙离子通道蛋白、LaminB1核纤层蛋白在原代培养的新生大鼠边缘细胞中是否表达。方法:选用新生Sprague Dawley乳鼠(p0-p3)为实验对象,断头处理后在解剖显微镜下分离外侧壁,眼科剪剪切成微小的组织块,利用酶消化法将细胞悬液接种在六孔板上。利用含2%胎牛血清的动物上皮培养基培养,隔天换液。吹打纯化后制成细胞爬片,采用免疫荧光法检测上皮细胞特异性角蛋白CK-18、Cav1.3钙离子通道蛋白、LaminB1核纤层蛋白的表达。结果:倒置光学显微镜下,24小时内可见大部分接种的细胞团块贴壁良好。培养第4-5天时,多角形的边缘细胞和梭形的成纤维细胞混合生长。MCs呈多角形,大小不一,颜色较暗,界限清楚,细胞之间连接紧密,形成典型的铺路石样外观。7-9天时,数百个多角形的边缘细胞以及周围的液体区域形成“dome”结构。14天后,多角形细胞体积变大,胞质内颗粒样物质增多,出现多核或者大核,细胞骨架明显,直至崩解。免疫细胞化学法检测细胞角蛋白CK-18、Cav1.3钙离子通道蛋白、LaminB1核纤层蛋白表达阳性。结论:成功建立了新生大鼠血管纹边缘细胞体外培养体系,为研究边缘细胞的生理功能奠定了技术基础。经过免疫细胞化学实验首次证实了新生大鼠的边缘细胞具有表达Cav1.3钙离子通道蛋白、LaminB1核纤层蛋白的能力,初步揭示了Cav1.3、LaminB1在耳蜗发育中扮演一定的角色,为后续实验奠定了理论基础。第二部分:Cav1.3钙离子通道蛋白在SD大鼠耳蜗组织中的发育性表达目的:研究Cav1.3钙离子通道在新生大鼠耳蜗外侧壁和基底膜发育过程中的表达变化,探讨其在听觉生理过程中的作用。方法:取不同发育时期(0天、7天、14天、21天)SD大鼠为实验对象。利用免疫荧光组织化学染色法、逆转录聚合酶连反应法、实时定量PCR法检测Cav1.3在耳蜗外侧壁(血管纹和螺旋韧带)和基底膜(包括内、外毛细胞)的蛋白以及m RNA水平的表达含量。结果:免疫荧光和逆转录聚合酶连反应显示:Cav1.3钙离子通道在内外毛细胞、血管纹和螺旋韧带均有表达。实时定量PCR法证明Cav1.3钙离子通道在耳蜗外侧壁和基底膜的表达随着发育逐渐增多。结论:Cav1.3钙离子通道在SD大鼠耳蜗中的表达含量随发育逐渐增多。Cav1.3表达量的上调可能与耳蜗的发育、听力的形成、内耳钙离子的稳态、耳蜗内电位(EP)的产生和调节以及听觉功能的正常发挥密切相关。本研究的实验结果为进一步阐明Cav1.3钙离子通道在听觉系统中的作用提供了理论基础。第三部分:Lamin B1蛋白在新生大鼠耳蜗中的发育性表达及意义目的:Lamin B1是一种有效的调节因子,在细胞增殖、细胞分化、神经元细胞迁移和大脑发育等方面有重要的作用。我们旨在研究出生后大鼠耳蜗的形态变化和Lamin B1在耳蜗发育阶段的年龄相关性表达,探讨Lamin B1蛋白与耳蜗发育以及听觉功能的关系。方法:使用新生Sprague-Dawley大鼠(p0、p7、p14、p21)为实验模型。在显微镜下分别解剖分离四个发育阶段的耳蜗膜迷路组织:血管纹(STV,包括螺旋韧带,下同),基底膜(BM,包括Corti器官,下同)和螺旋神经节(SGC)。采用HE染色和电镜观察耳蜗发育过程中的形态变化,并且应用免疫荧光、实时定量PCR和免疫印迹技术从m RNA和蛋白质水平检测Lamin B1在四个发育阶段耳蜗组织中的表达变化。结果:HE染色结果显示耳蜗基底膜、血管纹、螺旋神经节在出生21天内经历了从不成熟到成熟的演变。免疫荧光法证明各发育阶段耳蜗内的Lamin B1主要分布于内外毛细胞、K?lliker器官、前庭膜、螺旋神经节、血管纹和螺旋韧带。刚出生时荧光强度达到峰值,而后开始减弱,14天时迅速减弱,21天时荧光强度最低。另外,Western blot和RT-PCR结果证明Lamin B1的蛋白和m RNA在耳蜗组织(外侧壁、螺旋神经节、基底膜)中的相对表达量,随着发育均逐渐减少。结论:耳蜗在发育过程中经历了许多典型的形态学改变。Lamin B1在耳蜗组织中的表达含量也随着发育逐渐变化,与听觉形成的时间匹配。表明Lamin B1可能通过调节耳蜗结构的发育促进了听觉功能的发育和形成。另外,Lamin B1和Cav1.3在耳蜗中的分布相似,而且在发育过程中都发生了调节性变化,提示两种蛋白在耳蜗中有相似的作用,两者均参与了听觉发育及形成机制,也进一步证明了Lamin B1在耳蜗中也扮演重要的角色。第四部分:核纤层蛋白Lamin B1在大鼠耳蜗中的选择性表达及作用目的:Lamin B1是核纤层的重要组成成分,能够有效调控细胞增殖和细胞分化。本实验旨在研究Lamin B1在大鼠耳蜗不同组织中的表达差异并探讨其与听觉功能的关系。方法:以不同发育阶段(p0、p7、p14、p21)的SD大鼠为研究对象。应用免疫荧光法检测Lamin B1在大鼠耳蜗不同组织中的分布差异,采用Western blot和实时定量PCR检测在整个发育阶段,Lamin B1蛋白和m RNA在耳蜗基底膜(BM,包括Corti器官,下同)、螺旋神经节(SGC)和血管纹(STV,包括螺旋韧带,下同)中的表达变化。结果:免疫荧光染色显示Lamin B1主要分布于毛细胞(HCs)、螺旋神经节、血管纹、螺旋韧带(SL,spiral ligament)、前庭膜(RM)和螺旋缘(LLS)。出生0-14天,Lamin B1基因的m RNA在不同耳蜗组织之间的表达没有差异。出生14天时,Lamin B1蛋白水平在螺旋神经节和基底膜中的表达比血管纹和螺旋韧带多,但是螺旋神经节和基底膜的Lamin B1表达含量没有统计学差异。Western blot和PCR结果均表明出生21天时Lamin B1在大鼠耳蜗中的分布具有组织特异性,螺旋神经节最多,基底膜次之,而缺乏神经细胞的血管纹与前两者相比则表达量较少。结论:初步揭示了Lamin B1在发育时期不同耳蜗组织中的表达模式,指出Lamin B1在成年大鼠耳蜗组织中的表达具有组织特异性,可能与听神经细胞和听觉的发育及功能的发挥有密切的关系。另外,Lamin B1耳蜗中的选择性表达模式和Cav1.3相同,进一步证明了Lamin B1在耳蜗中与关键离子通道蛋白有一定关系,并在听觉发育及形成机制中具有重要作用。
【学位单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R764
【部分图文】：

至3天六孔板中的细胞数目增长较慢。培养第四天，多角形的边缘细胞(MCs)和梭形的成纤维细胞混合生长。MCs呈多角形，大小不一，颜色较暗，界限清楚。细胞之间连接紧密，单层极性排列，形成典型的铺路石样外观（图.1A）。7-9天时，数百个多角形的边缘细胞以及周围的液体区域形成“dome”结构（图.1B），说明边缘细胞具有分泌功能，此时MCs分布在不同的层面。第14天后，多角形细胞体积变大，胞浆内空泡越来越多，呈“泡沫样”外观，胞质内颗粒样物质增多，出现多核或者大核，细胞骨架明显，直至崩解。此时，长梭形的成纤维细胞增多，挤占了边缘细胞的生长空间。图.1原代培养的新生大鼠血管纹边缘细胞的形态学观察 A: 第4-5天时，边缘细胞为不规则的多角形

16细胞中，而血管纹中只有边缘细胞属于上皮细胞，所以，多角形细胞为边缘细胞。图.2 原代培养的新生大鼠血管纹边缘细胞的化学鉴定 A:细胞角蛋白CK-18在胞质中表达阳性，呈红色荧光； B:胞核用DAPI染色，呈蓝色荧光（三）Cav1.3钙离子通道在MCs中的表达通过免疫荧光的方法(图.3-4)，我们首次观察了Cav1.3在原代培养的新生大鼠血管纹边缘细胞中的表达。(图.3)我们用红色荧光来标记MCs的角细胞蛋白CK-18，绿色荧光标记目的蛋白Cav1.3，进行双染；(图.4) 我们用绿色荧光标记目的蛋白Cav1.3进行单染。通过观察发现，Cav1.3钙离子通道主要表达在边缘细胞胞质中。图.3 Cav1.3钙离子通道在原代培养新生大鼠耳蜗血管纹边缘细胞的表达(免疫荧光)。细胞核DAPI染色后显示蓝色荧光；细胞角蛋白CK-18在边缘细胞胞质中表达阳性，呈现红色荧光；绿色荧光显示的是Cav1.3钙离

图.2 原代培养的新生大鼠血管纹边缘细胞的化学鉴定 A:细胞角蛋白CK-18在胞质中表达阳性，呈红色荧光； B:胞核用DAPI染色，呈蓝色荧光（三）Cav1.3钙离子通道在MCs中的表达通过免疫荧光的方法(图.3-4)，我们首次观察了Cav1.3在原代培养的新生大鼠血管纹边缘细胞中的表达。(图.3)我们用红色荧光来标记MCs的角细胞蛋白CK-18，绿色荧光标记目的蛋白Cav1.3，进行双染；(图.4) 我们用绿色荧光标记目的蛋白Cav1.3进行单染。通过观察发现，Cav1.3钙离子通道主要表达在边缘细胞胞质中。
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本文编号：2862522