巨噬细胞自噬与格子状角膜营养不良发病关系的研究

发布时间：2020-11-14 23:05

　　 目的:格子状角膜营养不良(Lattice corneal dystrophy,LCD)是一种因转化生长因子-β诱导基因(TGFBI)突变导致其基因产物蛋白(TGFBIp)淀粉样变性的遗传性疾病。变性的TGFBIp沉积于角膜基质层,引起角膜结构和功能损伤,造成视力障碍甚至完全丧失。因此,有效清除变性TGFBIp是LCD治疗的关键。目前,阿尔兹海默病(AD)是淀粉样变性蛋白所致疾病中研究最为深入的一种,AD患者大脑中的小胶质细胞(一种巨噬细胞)可通过自噬降解淀粉样变性蛋白。近年研究发现,颗粒状角膜营养不良(GCD)患者的角膜成纤维细胞中存在自噬清除变性TGFBIp的功能障碍。至今,还没有任何关于巨噬细胞是否通过自噬降解LCD角膜变性蛋白的研究。因此,本研究旨在了解巨噬细胞是否通过自噬降解LCD的变性TGFBIp,同时了解这种变性蛋白质降解与LCD发病的关系。方法:对海南省一LCD家系进行遗传病调查和研究。应用裂隙灯显微镜观察先证者和家系患病成员角膜,获取先证者角膜进行组织病理学染色;采取患者外周血提取DNA并测序检测TGFBI基因所有17个外显子,与基因库数据比对以确定其基因型。对先证者角膜组织进行荧光染色,观察TGFBIp和CD11b的荧光分布关系。分离本家系患者外周血单个核细胞(PBMC),用GM-CSF诱导为巨噬细胞后与基因重组野生型(正常)或突变型(变性)TGFBIp进行共培养,并进行相应的检测和观察。重组TGFBIp处理巨噬细胞5 h后,去除培养基中TGFBIp再继续培养5 h,分别在0、2.5、5、7.5、10 h时间点进行检测。Western blot(WB)检测巨噬细胞内TGFBIp含量、细胞CD36和CD68表达水平以及自噬相关分子LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、SQSTM1的表达水平;用酶联免疫吸附试验检测培养基中TGFBIp浓度变化。对巨噬细胞进行荧光染色,利用共聚焦显微镜观察TGFBIp和CD11b的共定位以确定巨噬细胞与TGFBIp的关系;观察内源性LC3斑点和TGFBIp的共定位情况,同时也观察内源性LC3斑点和LAMP1的共定位情况以确定自噬及其完整性。利用流式细胞术检测巨噬细胞CD36和CD68在不同时间点的表达水平。结果:本研究所调查的LCD家系共有25名成员,其中14人被确诊LCD。基因测序发现所有患者都存在TGFBI基因的点突变,即1673位点碱基T替换为C(c.1673 TC),导致TGFBIp 558位点的亮氨酸替换为脯氨酸(p.Leu558Pro)。在病变角膜组织中发现明显的TGFBIp聚集和巨噬细胞浸润。患者来源的巨噬细胞对WT TGFBIp和MU TGFBIp均有相似的初始内吞能力,在外源性TGFBIp存在的情况下细胞内TGFBIp含量相似,但外源性TGFBIp去除后,MU TGFBIp处理的巨噬细胞内仍有较高浓度的MU TGFBIp,相反WT TGFBIp处理的巨噬细胞内WT TGFBIp则基本检测不到;使用抑制剂3-MA或leupeptin后,巨噬细胞中的WT TGFBIp与MU TGFBIp含量在各时间点均相似,而在MG132作用下无此现象。WT TGFBIp处理的巨噬细胞发现有CD36和CD68高表达,而MU TGFBIp处理的巨噬细胞的表达变化则不明显。用WB检测自噬相关分子LC3-Ⅱ发现,WT TGFBIp和MU TGFBIp处理的巨噬细胞中均有LC3-Ⅱ的显著高表达;但在TGFBIp去除后,MU TGFBIp处理巨噬细胞的LC3-Ⅱ高表达仍稳定保持,而WT TGFBIp处理巨噬细胞的LC3-Ⅱ则基本恢复至未接触TGFBIp时的基础水平。共聚焦显微镜观察到的LC3与TGFBIp共定位情况也与以上WB检测结果类似。此外,用WB检测还发现,WT TGFBIp处理的巨噬细胞中SQSTM1含量明显下降,但在MU TGFBIp处理的巨噬细胞中SQSTM1则保持含量不变;共聚焦显微镜观察发现,WT TGFBIp处理的巨噬细胞中有明显的LC3和LAMP1共定位。此外,3-MA阻断自噬后,用WB和流式细胞术检测CD68和CD36表达,发现这两种分子的表达与未阻断前有明显不同,即WT TGFBIp和3-MA处理的巨噬细胞中这两种分子表达水平均显著下降,并与单纯MU TGFBIp处理的巨噬细胞表达水平相似。结论:以上实验结果表明,本家系TGFBI基因突变为c.1673 TC,引起蛋白变性(p.Leu558Pro);变性的TGFBIp沉积于角膜是导致LCD病变的一种重要原因;巨噬细胞自噬降解变性TGFBIp的过程中出现自噬流不完整,表现为自噬小体不能有效形成自噬溶酶体;巨噬细胞对变性TGFBIp的不完整自噬不仅造成变性TGFBIp的降解失常,同时还降低巨噬细胞的吞噬活性,从而降低巨噬细胞对TGFBIp持续性内吞和降解清除的能力,加重变性TGFBIp在角膜部位的沉积聚集。因此,设法恢复巨噬细胞对变性TGFBIp的完整自噬和有效降解有可能成为LCD治疗的新策略。
【学位单位】：海南医学院
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R772.2
【部分图文】：

图 1. 本研究格子状角膜营养不良家系图谱。实心和空心图标分别表示患病和患病者。箭头代表先证者。Figure 1. Pedigree of family with lattice corneal dystrophy. Filled and open symrepresent affected and unaffected individuals, respectively. Arrowhead indicatesproband.对先证者的 27 岁女儿（图 1，Ⅲ-5）进行裂隙灯显微镜检查，发现了在大

.（A）先证者女儿（Ⅲ-5）裂隙灯显微镜检查图片；（B）先证者角膜组检查（刚果红染色）re 2. (A) Slit lamp photomicrographs of the daughter of proband (III-5opathological examination of the cornea from the proband displays poing with Congo red.

导致蛋白质 558 位点亮氨酸被替换为脯氨酸（p.Leu558Pro，图 3）图 2.（A）先证者女儿（Ⅲ-5）裂隙灯显微镜检查图片；（B）先证者角膜组理学检查（刚果红染色）Figure 2. (A) Slit lamp photomicrographs of the daughter of proband (III-5Histopathological examination of the cornea from the proband displays postaining with Congo red.
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本文编号：2884051