间质蛋白Periostin对鼻咽癌6-10B细胞凋亡的影响及其机理的初步研究

发布时间：2017-04-07 10:21

  本文关键词：间质蛋白Periostin对鼻咽癌6-10B细胞凋亡的影响及其机理的初步研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:前期研究发现Periostin(POSTN)是高表达于鼻咽癌间质的一种分泌蛋白。临床资料分析发现POSTN与鼻咽癌的转移及患者预后密切相关,体外实验证实POSTN可以促进鼻咽癌细胞的增殖、侵袭和转移。本研究拟在前期研究的基础上,进一步探究POSTN对鼻咽癌细胞凋亡的影响及其可能的机理。方法:利用本室保存的鼻咽癌6-10B系列细胞株6-10B、6-10B-GFP(为稳转了空载体的6-10B)、6-10B-POSTN(为稳转了POSTN的6-10B),经Western Blot验证POSTN表达效果。接着用Western blot检测POSTN转染前后,6-10B细胞中P53、P-AKT、BAX等凋亡相关蛋白的表达水平;流式细胞术检测细胞凋亡率的改变。免疫组化检测正常鼻咽黏膜组织和鼻咽癌组织中P53蛋白的表达水平。提取稳转了POSTN的6-10B系列细胞和稳转了POSTN的成纤维系列细胞培养上清,分别刺激6-10B细胞,检测刺激前后6-10B细胞中P53、P-AKT、BAX等凋亡相关蛋白的表达水平。最后,构建能稳定干扰人P53表达的shRNA干扰载体,用shRNA干扰载体分别转染鼻咽癌细胞6-10B、6-10B-GFP、6-10B-POSTN细胞,Western Blot验证干扰的效果,流式细胞术检测P53干扰前后6-10B系列细胞的凋亡率。结果:(1)6-10B-POSTN细胞组凋亡率较6-10B组和6-10B-GFP组明显提高,6-10B-POSTN细胞内P53、BAX蛋白表达上调,P-AKT表达下调。(2)与正常的鼻咽黏膜组织相比,鼻咽癌组织中的P53蛋白表达水平明显升高。(3)6-10B-POSTN细胞培养上清能促进6-10B的凋亡,而来自3T3-POSTN培养上清并不能促进6-10B的凋亡。(4)成功构建能够稳定干扰6-10B细胞P53基因的shRNA载体,干扰6-10B细胞中的P53并不能降低6-10B细胞的凋亡率,而POSTN可以提高干扰了P53的6-10B细胞的凋亡率。结论:(1)间质蛋白Periostin可以促进鼻咽癌6-10B细胞的凋亡;(2)Periostin不是通过调控P53蛋白的表达来促进鼻咽癌6-10B的凋亡的(其促凋亡机制可能与BAX、P-AKT的表达变化有关)。
【关键词】：鼻咽癌 基因转染 Periostin P53 凋亡
【学位授予单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R739.63
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-12
• 第1章 引言12-16
• 第2章 材料与方法16-28
• 2.1 材料16-17
• 2.1.1 主要实验仪器16
• 2.1.2 实验用细胞系与菌株16-17
• 2.1.3 主要试剂17
• 2.2 实验方法17-27
• 2.2.1 细胞系的复苏、传代和冻存17-19
• 2.2.1.1 细胞的复苏17-18
• 2.2.1.2 细胞的换液18
• 2.2.1.3 细胞的传代18
• 2.2.1.4 细胞的冻存18-19
• 2.2.2 免疫组化检测正常鼻咽黏膜组织和鼻咽癌组织中P53的表达19
• 2.2.3 6-10B系列细胞瞬转P53干扰慢病毒载体19-24
• 2.2.3.1 P53干扰慢病毒载体的设计19-20
• 2.2.3.2 sh RNA的构建20-21
• 2.2.3.3 测序引物的设计21-22
• 2.2.3.4 P53干扰慢病毒载体的转化22
• 2.2.3.5 P53干扰慢病毒载体的扩增、提取22-24
• 2.2.3.6 P53干扰慢病毒载体的瞬转24
• 2.2.4 流式细胞术测定 6-10B系列细胞凋亡率24-25
• 2.2.5 6-10B-POSTN系列细胞培养上清的收集及其对 6-10B细胞的处理25
• 2.2.6 3T3-POSTN系列细胞培养上清的提取及其对 6-10B细胞的处理25
• 2.2.7 6-10B系列细胞的总蛋白的提取25-26
• 2.2.8 Western Blot26-27
• 2.3 技术路线27-28
• 第3章 实验结果28-36
• 3.1 检测Periostin在转染前后鼻咽癌细胞株中的表达28
• 3.2 检测POSTN高表达后 6-10B细胞内促凋亡相关蛋白P53、BAX，抑凋亡相关蛋白P-AKT的表达28-29
• 3.3 流式细胞术检测 6-10B细胞中POSTN表达上调后凋亡情况29-30
• 3.4 检测 P53 在人正常鼻咽黏膜和鼻咽癌组织中的表达30-31
• 3.5 6-10B系列细胞培养上清对 6-10B细胞中凋亡相关蛋白表达的影响31
• 3.6 检测转染shRNA前后，鼻咽癌 6-10B细胞P53的干扰效果及鼻咽癌 6-10B系列细胞的凋亡率31-35
• 3.7 3T3-POSTN细胞培养上清对 6-10B细胞中凋亡相关蛋白表达的影响35-36
• 第4章 讨论36-40
• 第5章 结论40-42
• 第6章 参考文献42-46
• 综述 间质蛋白 Periostin 及其与肿瘤关系的研究进展46-62
• 参考文献55-62
• 附录62-68
• 作者攻读学位期间的科研成果68-70
• 致谢70

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