叶酸靶向共载TFPI-2及顺铂磁性纳米复合物的制备及靶向治疗鼻咽癌的研究

发布时间：2017-04-08 01:09

  本文关键词：叶酸靶向共载TFPI-2及顺铂磁性纳米复合物的制备及靶向治疗鼻咽癌的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究背景鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma,NPC)是头颈部常见恶性肿瘤,其发病率以我国的南方较高。放射治疗是NPC首选治疗手段。虽然放疗技术和设备不断地更新,晚期NPC单纯放射治疗的平均5年生存率大概52%。放化疗相结合的综合治疗为目前临床最常应用的方法,但由于肿瘤转移、多重耐药及化疗药物的不良反应等原因,总的生存率仍不理想。近年来,化疗在鼻咽癌的治疗作用越来越受到重视。化疗主要是利用化学药物抑制癌细胞的增殖、浸润及转移,最终促使癌细胞凋亡坏死的一种治疗方式。然而化疗药物的选择性弱,在促使癌细胞凋亡坏死的同时也会损伤人体正常细胞,不可避免的产生药物的不良反应。顺铂(cisplatin,CDDP)是最常用的广谱抗肿瘤化疗药物之一,具有抗癌活性高、抗癌作用强等特点,可与5-氟尿嘧啶(5-FU)等多种抗癌药物联合使用,可产生协同作用且无明显交叉耐药的特点,被推荐治疗非小细胞肺癌、黑色素瘤、头颈部癌和卵巢癌等癌症的首选药物。和许多其他的抗肿瘤药物一样,CDDP在临床中存在靶向性低,副作用大,如肾脏毒性、神经毒性、骨髓抑制和胃肠道反应等,水溶性低及在体内代谢速度快等缺点限制了其治疗指数的提高。已有很多研究采用相关材料,如利用聚天冬氨酸的衍生物,聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG),聚天冬氨(poly(asparticacid), PASP)作为药物载体。所得载CDDP药物能降低CDDP的细胞毒性,并提高抗癌活性,但此载体存在载药效率不高、载体合成困难等问题,且缺乏特异性分子主动靶向性。肿瘤基因治疗以改变人体遗传物质为基础,将具有治疗作用的基因导入肿瘤细胞,直接针对肿瘤的异常的基因而发挥治疗肿瘤的作用。基因治疗开辟了治疗肿瘤的新途径,靶向基因治疗及化疗的联合应用在NPC治疗中显示出良好的临床应用前景。组织途径抑制因子2(Tissue facor pathway inhibitor-2, TFPI-2)是一种广谱丝氨酸蛋白酶抑制物,能有效抑制基质金属蛋白酶(Matrix metallo proteinase, MMP)家族的蛋白水解酶活性,在维持细胞外基质(Matrixmetalloproteinase, ECM)的结构完整,抑制肿瘤细胞增殖、浸润、转移及促进凋亡等方面起重要作用。TFPI-2广泛分布于在人体肝脏、肾脏、心脏、骨骼肌等正常组织中,而在肿瘤组织如宫颈癌、胰腺癌中TFPI-2的表达降低,而促进肿瘤的侵袭转移。我们课题组也发现在鼻咽癌组织中TFPI-2表达下降,伴有淋巴结转移的癌组织TFPI-2表达水平低于无淋巴结转移的癌组织。以前的研究表明TFPI-2能明显抑制肺癌细胞、神经胶质瘤细胞、黑色素瘤细胞、卵巢癌细胞等的侵蚀转移。但以前所广泛采用的脂质体载体毒性较大,病毒载体转染率不理想,而且存在病毒活化的危险,且缺乏靶向性。我们课题组研究发现,叶酸受体(folate receptor, FR)在人体鼻咽癌组织及HNE-1细胞中高度表达,并随着鼻咽癌临床分期增加而表达增加,而在正常鼻粘膜组织中FR不表达,FR已经成为多种恶性肿瘤的研究靶点。叶酸(folic acid,FA)是人体细胞一种必需的维生素,与叶酸受体具有高度亲和性,且FA与其他分子偶联后仍可保持与FR的亲和性,并通过胞吞作用特异性的摄入细胞内。已报道的偶联FA的基因载体有FA-EPOPC:CHOL、FA-PEG-PEI等,与未偶联FA的载体比较,对FR阳性的HEK293T细胞、C6细胞和KB细胞能特异性的提高基因转染效率,抗肿瘤效应更强。叶酸靶向载化疗药物(如阿霉素、紫杉醇)能选择性的识别并靶向进入.bel 7402细胞、KB细胞及裸鼠移植瘤,可明显增加抗肿瘤效应。FA介导的细胞内胞吞机制及FR表达的组织分布特点为恶性肿瘤的靶向载药和释药奠定了理论基础,为增强常规化疗和基因治疗的特异性提供了条件。磁性纳米具有纳米粒的一般特性,如粒径小、表面曲率大等,还具有磁场靶向性。已有研究发现偶联FA的磁性纳米粒子可特异性地到达肿瘤靶组织,可用于肿瘤的诊断和治疗。基因与纳米粒子结合后,可以更有效的保护基因,提高细胞转染率,靶向定位输送。我们课题组已制备出具有叶酸靶向效应的磁性纳米载体,并进行了载顺铂靶向治疗NPC的研究,稳定性好,治疗效果满意。但该纳米载体带负电荷,难于吸附带负电荷的基因。多聚乙烯基亚胺(Polyethyleneimine,PEI)是人工合成的具有极高密度正电荷的有机高分子阳离子聚合物,可与DNA通过正负电荷作用相互吸引而形成稳定的复合物,且可被细胞所摄取。然而PEI具有较大的细胞毒性,并且PEI/DNA复合物溶解性欠佳限制了其作为基因载体的应用。有研究显示,如果将阳离子共聚物链接上非离子的亲水性基团,如聚乙二醇(PEG),不仅可改善溶解性的问题,还可降低药物载体的细胞毒性,延长药物载体在体内的循环时间、减少非特异性吸附等。已有实验合成PEI-PEG共聚物包裹Fe304纳米颗粒为基因载体,但缺乏高效分子靶向性。我们采用酰胺化反应制备了MPEG-PEI-FA共聚物,并将其作为表面改性剂,与带负电荷的醛基化海藻酸钠改性的Fe304纳米颗粒连接,以其作为CDDP和基因载体,通过化学反应和静电吸附作用将CDDP和基因连接在载体内,成功制备了共载CDDP与TFPI-2基因的叶酸靶向磁性纳米复合物,以叶酸受体阳性的HNE-1和叶酸受体阴性的CNE-2鼻咽癌细胞作为研究对象,通过体内外实验研究该磁性纳米复合物的叶酸分子靶向性及综合抑癌效果。研究目的构建叶酸(folic acid, FA)分子靶向载组织途径抑制因子2(TFPI-2)及顺铂(cisplatin,CDDP)的磁性纳米(magnetic nanoparticles,MNP)复合物(FA-MNP/CDDP/TFPI-2),研究该复合物对叶酸受体(folate receptor, FR)阳性鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma, NPC)的分子靶向性及综合抑制能力。研究方法1.制备FA-MNP/CDDP/TFPI-2通过化学共沉淀法制备载顺铂的磁性纳米复合物MNP-CDDP和酰胺化反应制备、酰胺化反应制备FA(-MEPG-PEI)/TFPI-2,再通过静电吸附合成最后通过静电吸附合成FA-MNP/CDDP/TFPI-2。2. FA-MNP/CDDP/TFPI-2表征分别通过透射电镜、傅里叶变换红外光谱、核磁共振氢谱、激光粒度仪观察复合物的形态、结构、粒径大小及zeta电位,邻苯二胺(o-phenylenediamine, OPDA)法与紫外分光光谱分析分别检测复合物中CDDP与FA含量,琼脂糖凝胶电泳观察质粒与磁性纳米载体最佳结合的情况。3.体外实验体外实验采用普鲁士蓝铁染色(Prussian blue staining)及荧光显微镜观察NPCFR阳性HNE-1细胞及FR阴性CNE-2胞内FA-MNP/CDDP/TFPI-2摄取及TFPI-2质粒表达情况。通过流式细胞仪检测载体基因转染效率进一步分析磁性纳米复合物转染TFPI-2质粒的情况。RT-PCR和Western blot法检测HNE-1和CNE-2细胞转染TFPI-2质粒后细胞内TFPI-2 mRNA和蛋白表达情况。采用CCK-8实验、Matrigel体外侵袭实验及流式细胞实验检测FA-MNP/CDDP/TFPI-2对HNE-1细胞毒性、细胞增殖及凋亡的影响。4.体内实验体内实验采用活体成像及核磁共振(MRI)观察荷瘤裸鼠尾静脉注射FA-MNP/CDDP/TFPI-2后,同时种荷HNE-1和CNE-2两种瘤的裸鼠种植瘤吞噬该复合物情况。Tunnel实验观察尾静脉注射FA-MNP/CDDP/TFPI-2后,同时观察荷HNE-1和CNE-2两种瘤组织中细胞的凋亡坏死情况。实验结果磁性纳米复合物成功合成,透射电镜显示磁性纳米粒分散均匀,呈球形,单个磁核约9nm。FA-MNP/CDDP/TFPI-2平均水动力学粒径为151 nm, Zeta电位+15.4 mV。复合物中CDDP的含量平均为150ug/ml,包封率为37.25%。琼脂糖凝胶电泳结果显示磁性纳米载体与质粒在质量比10：1时能有效结合并保护质粒。荧光显微镜下HNE-1细胞内可见有较强的绿色荧光蛋白(GFP)表达,约37.4%,而CNE-2细胞内表达较弱,约27.2%,提示FA-MNP/CDDP/TFPI-2获得靶向转染。普鲁士铁染色结果也显示HNE-1摄取的磁性纳米复合物明显比CNE-2多。HNE-1转染载TFPI-2质粒复合物后,细胞内TFPI-2 mRNA和蛋白表达明显增加。FA-MNP/CDDP/TFPI-2共培养组细胞生长抑制率及凋亡率分别为37.2%和44.6%,均明显高于FA-MNP/CDDP对照组(23.4%,32.7%)和FA-MNP /TFPI-2组(17.3%,13.9%)。Matrigel侵袭实验显示FA-MNP/CDDP/TFPI-2组比对照组HNE-1细胞侵袭能力明显降低。流式检测FA-MNP/CDDP/TFPI-2阻止细胞增殖主要在S期及G2期。活体成像显示FA-MNP/CDDP/TFPI-2靶向到达FR阳性的HNE-1瘤块,而FR阴性的CNE-2瘤块未见明显标记的绿色荧光蛋白的表达。核磁共振显示FA-MNP/CDDP/TFPI-2在T2条件下HNE-1瘤块比CNE-2瘤块信号明显降低。。Tunnel实验提示FA-MNP/CDDP/TFPI-2尾静脉注射23d后,荷瘤鼠HNE-1瘤块比CNE-2瘤块内的细胞调亡明显。结论成功构建了具有叶酸(FA)分子靶向性能的共载基因(TFPI-2)及顺铂(CDDP)的磁性纳米复合物(FA-MNP/CDDP/TFPI-2),体内外实验显示对叶酸受体阳性HNE-1细胞具有良好的综合抑制效应。
【关键词】：鼻咽癌 磁性纳米 靶向性 顺铂 叶酸 组织途径抑制因子2(TFPI-2)
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R739.63
【目录】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-16
• 前言16-20
• 参考文献17-20
• 第一部分 磁性纳米复合物(FA-MNP-CDDP/TFPI-2)的制备与表征20-38
• 1. 材料与方法21-28
• 2. 结果28-32
• 3. 讨论32-33
• 4. 结论33
• 参考文献33-38
• 第二部分 磁性纳米复合物(FA-MNP-CDDP/TFPI-2)对鼻咽癌的靶向性实验研究38-56
• 1. 材料与方法39-47
• 2. 结果47-52
• 3. 讨论52-53
• 4. 结论53
• 参考文献53-56
• 第三部分 磁性纳米复合物(FA-MNP-CDDP/TFPI-2)对鼻咽癌抑制实验56-72
• 1. 材料与方法57-63
• 2. 结果63-67
• 3. 讨论67-68
• 4. 结论68-69
• 参考文献69-72
• 全文总结72-73
• 主要英文缩略词表73-74
• 攻读学位期间成果74-75
• 致谢75-76

【参考文献】

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1 杨扬;张大鹏;吴兰;郭怀祖;聂丽;钱卫珠;王皓;李博华;;抗CD20人源化抗体的制备及生物学活性鉴定[J];现代免疫学;2009年06期

2 王振宁;许海楠;郭潇繁;;靶向治疗在肿瘤新辅助治疗中的应用[J];中国实用外科杂志;2010年07期

  本文关键词：叶酸靶向共载TFPI-2及顺铂磁性纳米复合物的制备及靶向治疗鼻咽癌的研究，，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：291725