CD47在喉鳞状细胞癌中的表达及临床意义和对喉癌细胞生物学行为的影响

发布时间：2017-04-08 10:17

  本文关键词：CD47在喉鳞状细胞癌中的表达及临床意义和对喉癌细胞生物学行为的影响，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:检测CD47在喉鳞状细胞癌组织中的表达水平,分析其与临床病理参数的关系,并探讨在体外实验中以重组慢病毒为载体沉默CD47基因及抗CD47单克隆抗体(抗CD47单抗)对喉癌细胞Hep-2增殖、凋亡及侵袭等细胞生物学行为的影响,为喉癌的分子靶向治疗提供理论依据。方法:1、用蛋白印记Western blot检测CD47在喉鳞状细胞癌组织及癌旁正常喉上皮组织中的表达水平,并分析其与喉癌临床病理参数之间的关系,证明其在喉癌中的意义;2、构建CD47干扰慢病毒载体,以构建好的CD47-RNA干扰慢病毒载体(CD47-RNAi-LV)干扰喉癌细胞株Hep-2,设立正常对照组、阴性对照组、CD47-RNAi-LV 1、CD47-RNAi-LV2、CD47-RNAi-LV3、CD47-RNAi-LV 4转染组,荧光显微镜下初步观察转染率,并运用Western blot检测转染前、后Hep-2细胞中CD47蛋白的表达,筛选出干扰效率最高的RNAi片段;3、采用MTT比色法、流式细胞术、Transwell细胞侵袭实验检测RNA干扰及抗CD47单抗两种方式对喉癌细胞Hep-2增殖、凋亡及侵袭能力的影响。结果:1、CD47蛋白在喉鳞状细胞癌组织中的表达水平要明显高于癌旁正常喉上皮组织,差异具有统计学意义(P0.01),CD47在喉鳞状细胞癌组织中的表达水平与肿瘤T分期、临床分期及淋巴结转移相关,差异具有统计学意义(P0.05),而与患者的年龄和病理分化程度无显著关系,差异无统计学意义(P0.05)。2、CD47-RNAi-LV能高效地转入喉癌Hep-2细胞中,荧光显微镜下观察其转染率达90%以上,Western blot显示转染后Hep-2细胞中CD47蛋白表达抑制率可高达87.03%。3、MTT比色法结果显示:干扰后第1-3天干扰组与正常对照组及阴性对照组对细胞生长抑制率无统计学差异(p0.05),抗CD47单抗组与其他各组比均有统计学意义(p0.05),第4-7天干扰组及抗CD47单抗组与对照组比有统计学意义(p0.05)。流式细胞术检测各组的凋亡率(%),分别为:正常对照组0.28±0.04,阴性对照组0.40±0.05,干扰组3.75±0.26,抗体组4.08±0.27,干扰组、抗体组分别与正常对照组及阴性对照组相比均具有显著差异(p0.01),干扰组与抗体组比无统计学意义(p0.05)。Transwell侵袭实验结果显示24h各组间细胞穿膜数无统计学意义(p0.05),48h、72h干扰组及抗体组细胞穿膜数量较正常对照组及阴性对照组均明显下降(p0.05),干扰组及抗体组间差异无统计学意义(P0.05)。结论:CD47在喉鳞状细胞癌组织中表达增高,干扰CD47基因和抗CD47单抗能抑制喉癌细胞的增殖、侵袭能力,促进细胞凋亡,且两者作用效果一致。
【关键词】：喉肿瘤 癌 鳞状细胞 CD47 生物学行为
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R739.65
【目录】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-10
• 第1章 引言10-12
• 第2章 材料12-16
• 2.1 标本及细胞系12
• 2.1.1 标本12
• 2.1.2 细胞系12
• 2.2 主要实验设备12-13
• 2.3 主要试剂及耗材13-14
• 2.4 自配试剂14-16
• 第3章 实验方法16-23
• 3.1 蛋白印迹Western blot检测喉癌组织中CD47蛋白的表达16-18
• 3.1.1 总蛋白提取16
• 3.1.2 蛋白浓度测定(BCA法)16
• 3.1.3 SDS-PAGE电泳16-17
• 3.1.4 转膜17
• 3.1.5 封闭17
• 3.1.6 化学发光、显影、定影17-18
• 3.1.7 凝胶图像分析18
• 3.2 人喉癌细胞Hep-2 的培养18-19
• 3.2.1 细胞的复苏18
• 3.2.2 细胞传代18-19
• 3.3 Hep-2 细胞的转染19-20
• 3.3.1 Hep-2 细胞感染预实验19
• 3.3.2 重组慢病毒转染喉鳞癌细胞Hep-219-20
• 3.3.3 Western blot检测慢病毒转染NC-LV及CD47-RNAi-LV后Hep-2细胞中CD47的表达量20
• 3.4 MTT法检测细胞活性变化20
• 3.5 Annexin V PE/7-AAD双染法检测细胞凋亡率20-21
• 3.6 Transwell侵袭实验检测细胞体外侵袭能力的变化21-22
• 3.7 统计学分析22-23
• 第4章 结果23-29
• 4.1 Western blot结果显示CD47在喉癌组织中呈高表达，，与肿瘤的T分期、临床分期及淋巴结转移有关23-24
• 4.2 CD47-RNAi-LV对Hep-2 细胞CD47蛋白表达的影响24-26
• 4.3 MTT法检测CD47对Hep-2 细胞增殖的影响26-27
• 4.4 流式细胞术检测CD47对Hep-2 细胞凋亡的影响27
• 4.5 Transwell细胞侵袭实验检测CD47对Hep-2 细胞侵袭能力的影响27-29
• 第5章 讨论29-32
• 第6章 结论和展望32-33
• 6.1 结论32
• 6.2 展望32-33
• 致谢33-34
• 参考文献34-37
• 攻读学位期间的研究成果37-38
• 综述38-44
• 参考文献42-44

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