晶状体衰老中Hsf4负调控p21的分子机制研究

发布时间：2020-12-21 01:55

　　背景白内障是导致失明的主要原因。UV照射、代谢异常、基因突变、老化等因素能导致眼睛中的晶状体代谢紊乱,晶状体混浊,这些是白内障的主要发病原因。哺乳动物眼睛中的晶状体是透明的结构,由两种细胞组成,上皮细胞和纤维细胞。上皮细胞主要排列在晶状体前半球,由单层细胞组成,具有终身增殖与分化的能力。其余部分是由终末分化的纤维细胞组成,主要维持晶状体的内部稳定及透明度。在哺乳动物的晶状体中,上皮细胞会经过细胞周期停滞、伸长并分化成晶状体纤维细胞。晶状体上皮对维持晶状体纤维的稳态起着至关重要的作用,影响晶状体的生长,分化与稳态。老年性白内障是白内障中最常见的类型,主要表现为晶状体浑浊,晶状体上皮细胞的衰老会使细胞增殖受抑制,细胞周期阻滞,导致白内障的发生。热休克因子（HSF）是介导热休克反应的主要转录因子,主要是转录调控热休克蛋白（Hsps）的表达。热休克蛋白作为分子伴侣保护细胞免受蛋白毒性等损伤。在热休克或在某些压力条件下,热休克因子结合热休克蛋白（HSPs）基因启动子上的热休克元件（HSE）,激活热休克蛋白基因的转录。哺乳动物中热休克因子至少由三个成员组成,Hsf1、Hsf2和Hsf4。Hsf4属... 

【文章来源】：河南大学河南省

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【学位级别】：硕士

【部分图文】：

敲除Hsf4的斑马鱼眼睛内出现明显的白内障

图 2.2 敲除 Hsf4 斑马鱼的晶状体具有衰老相关表型。（A）用解剖镊将 12 个月的的斑马鱼的晶状体从眼睛中剥离，用 500 μl 的 β-Gal 染色固定液固定 15 min，按孵育 1-2 h，在体式显微镜下观察晶状体着色情况。（B）将 12 个月的 Hsf4 mutant 用 100 μl 的 β-Gal 染色固定液固定 15 min，按说明书配制染色液孵育 1-2 h，在体状体上皮细胞着色情况。（C）取 WT、Hsf4 mutant 的成年斑马鱼的晶状体， Triz组织中的 RNA，通过 qRT-PCR 检测衰老相关的分泌因子 zIL1b、zIL15、zIF、zIL7az-CXCL12 的表达量。zβ-actin 为内参。2.3 在小鼠晶状体上皮细胞中敲除 Hsf4，导致不依赖表达量上升在小鼠晶状体上皮细胞中，利用 CRISPR/Cas9 技术在 Hsf4 基因的GFP 标签，敲除 Hsf4 基因。最终筛选出 3 株敲除 Hsf4 的细胞株，在前敲除细胞系中出现衰老的表型，如 β-半乳糖甘酶活性增高、衰老相关异染

许多刺激反应的重要介质[22]，当细胞受到外界刺激后，抑癌基因 p531 是 p53 的下游靶基因，p21 对 G1 期 CDK 起抑制作用，使细胞周期阻以我们猜想是否在敲除 Hsf4 小鼠晶状体上皮细胞中，引起 p21 表达p53-p21-RB 这条通路。首先我们铺两组野生型 mLEC 和敲除 Hsf4 的组细胞直接用正常培养基培养 24 h，另一组用正常培养基培养 12 h再恢复 12 h，收取细胞，用 NP40 裂解 30min，取上清液。免疫印迹p53、p-p53、GFP 的表达量，结果发现在 ctrl 的一组细胞中，与野生除 Hsf4 细胞系中 p21 的表达量上升（图 2.3 第 2.3.4 泳道），用 10JU上升更明显（图 2.3 第 6.7.8 泳道）。无论是否用 10JUV 处理，与野敲除 Hsf4 细胞系中 p-p53/S15、p53 的表达量几乎不变（图 2.3），在中 GFP 蛋白均表达出来（图 2.3）。因此在晶状体上皮细胞中敲除 H3 未发生磷酸化，p21 的诱导不依赖于 p53 这条通路。


本文编号：2928965