miR-20b-5p靶向AEN调控鼻咽癌细胞凋亡的作用与机制研究

发布时间：2021-02-25 14:47

　　目的:明确mi R-20b-5p对鼻咽癌细胞增殖、凋亡的影响,并探讨mi R-20b-5p靶向AEN调控鼻咽癌细胞增殖及凋亡的作用机制。方法:采用q RT-PCR检测mi R-20b-5p在鼻咽癌患者血清,鼻咽癌细胞株CNE1、HNE2、HONE1以及永生化的正常鼻咽上皮细胞NP69中的表达情况;以鼻咽癌细胞CNE1、HONE1为研究对象,分别转染NC对照、mi R-20b-5p mimics和mi R-20b-5p inhibitor上调或下调mi R-20b-5p的表达,并采用q RT-PCR检测进行验证细胞。平板克隆形成实验、CCK8法、裸鼠成瘤实验从体内外分别分析mi R-20b-5p表达改变对细胞集落形成、细胞增殖、裸鼠成瘤的影响;流式细胞术检测mi R-20b-5p mimics和mi R-20b-5p inhibitor转染48 h后细胞凋亡情况;采用生物信息学分析预测mi R-20b-5p下游靶基因,并采用荧光素酶报告基因检测进行验证;Western blot法检测mi R-20b-5p表达改变对细胞AEN、Caspase3、Parp、Bax、Bcl-2、Bcl-xl等... 

【文章来源】：南华大学湖南省

【文章页数】：97 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

miR-20b-5p在鼻咽癌细胞及患者样本中表达升高（a）qRT-PCR实验（以U6作为内参）分析miR-20b-5p在正常鼻咽上皮细胞NP69及鼻咽癌细胞

313.2miR-20b-5p在体外对鼻咽癌细胞生物学行为的影响为了进一步探究miR-20b-5p对鼻咽癌细胞生物学行为的影响，我们通过上海生工合成订购了miR-20b-5pmimics以及miR-20b-5pinhibitor，并通过在鼻咽癌细胞中转染以实现miR-20b-5p过表达以及敲低，并进一步来观察其对于细胞生物学行为的作用。我们在鼻咽癌细胞CNE1和HONE1中分别转染了miR-20b-5pmimics，miR-20b-5pinhibitor以及NC对照链，建立过表达或敲低miR-20b-5p的瞬时转染细胞，并用实时荧光定量PCR验证其转染效率（图3.2a和b），确认其效果后再进行后续实验。图3.2miR-20b-5pmimics及miR-20b-5pinhibitor转染效率验证（a）qRT-PCR检测miR-20b-5pmimics及miR-20b-5pinhibitor转染效率，此为CNE1细胞系结果。（b）qRT-PCR检测miR-20b-5pmimics及miR-20b-5pinhibitor转染效率，此为HONE1细胞系结果。(数据均来自3次独立重复试验，结果均用均值±标准差（SD）表示，组间采用t检验。“**”表示P＜0.01，“***”表示P＜0.001，均为与NC对照组比较的差异。）我们发现在临临样本中miR-20b-5p的高表达与患者的肿瘤侵犯范围较大以及较晚的临临分期有明显相关。因此，我们进一步通过以下实验分析miR-20b-5p对鼻咽癌细胞的生物学行为的影响。通过流式细胞实验检测凋亡发现，转染miR-20b-5pmimics组与NC对照组比较，鼻咽癌细胞的凋亡率下降，而敲低miR-20b-5p的转染了miR-20b-5pinhibitor组，则相对于NC对照组细胞的凋亡率有明显的增加（P<0.05）（图3.3a）。CCK8细胞增殖试验结果显示，转染miR-20b-5pmimics的鼻咽癌细胞的增殖能力较NC对照组表现为增强，而在瞬时转染miR-20b-5pinhibitor敲低miR-20b-5p的细胞中，与NC对照组比较，其细胞的增殖能力则明显减弱（图3.3b）。克隆形成实验结果表明，miR-20

32此外，我们还分别对于转染了miR-20b-5pmimics，miR-20b-5pinhibitor以及NC对照链的鼻咽癌细胞进行了transwell侵袭实验,检测miR-20b-5p对于鼻咽癌细胞侵袭的作用。结果发现,在转染了miR-20b-5pmimics以及miR-20b-5pinhibitor后与NC对照转染组相比穿过铺有基质胶的小室膜的细胞数目没有统计学差异（图3.4b）。上述结果说明，miR-20b-5p对于鼻咽癌细胞的侵袭没有作用或作用较弱，因此，我们后续实验将重点关注miR-20b-5p对鼻咽癌增殖及凋亡的作用。图3.3miR-20b-5p在体外对于鼻咽癌细胞生物学行为的影响（a）在鼻咽癌CNE1，HONE1细胞系分别进行了流式细胞术检测转染miR-20b-5pmimics，miR-20b-5pinhibitor以及NC对照链后细胞的凋亡情况，以及其对应的统计图。（b）CCK8实验检测鼻咽癌细胞CNE1，HONE1细胞增殖。（所有数据均来自3次独立重复试验，结果均用均值±标准差（SD）表示，组间采用t检验，“*”表示P＜0.05，“**”表示P＜0.01，“***”表示P＜0.001，均为与NC对照组比较的差异。）

【参考文献】：
期刊论文
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本文编号：3051127