焦亡关键蛋白GSDMD在小鼠真菌性角膜炎中的作用和机制研究
发布时间：2021-04-15 11:15
目的:真菌性角膜炎（Aspergillus fumigatus,AF）是由致病真菌侵犯受损角膜导致的感染性角膜炎,是因缺乏有效的治疗的棘手疾病之一。细胞焦亡在抵御微生物入侵的先天免疫阶段中发挥着重要作用。GSDMD蛋白是焦亡过程中关键执行者,也是不同焦亡途径的通用底物。本研究中,我们重在探究GSDMD蛋白在由烟曲霉菌诱导的小鼠真菌性角膜炎中的作用及机制。方法:1.收集临床上感染真菌性角膜炎患者和正常对照组患者的角膜组织,采用免疫荧光法检测非感染和感染真菌的人角膜中GSDMD蛋白的表达。使用烟曲霉菌分生孢子刺激人永生化角膜上皮细胞（Human corneal epithelium cells,HCECs）,通过定量聚合酶链式反应（Reverse transcription-PCR RT-PCR）和Western Bolt法检测正常和烟曲霉菌刺激4h、8h、12h、16h的HCECs中GSDMD蛋白的表达;细胞免疫荧光法检验正常和烟曲霉菌刺激8h后的HCECs中GSDMD蛋白的表达。2.基质内注入烟曲霉菌分生孢子建立12h、1d、2d、3d、5d、7d、10d、14d小鼠真菌性角膜炎动物模...
【文章来源】：青岛大学山东省
【文章页数】：59 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
（A-C）烟曲霉菌菌丝及分生孢子形态
结果16图2.（A-B）是对GSDMD进行免疫荧光染色，绿色的代表GSDMD，蓝色的代表DAPI。（A）为在健康人角膜组织中GSDMD的表达；（B）为在确诊为真菌性角膜炎患者的角膜组织中GSDMD的表达。2.2烟曲霉菌刺激人角膜上皮细胞中GSDMD的表达用烟曲霉分生孢子刺激HCECs8h后，采用细胞免疫荧光法处理细胞，检测HCECs中GSDMD蛋白的定位和表达。结果如图显示（图3.A-B），细胞中的GSDMD蛋白在烟曲霉菌刺激后表达明显增加，且主要表达在胞膜和胞质中。收集真菌孢子刺激4h、8h、12h和16h的细胞，用于PCR法检测HCECs中GSDMD的表达变化（图3.C）。观察到GSDMD的mRNA水平从感染真菌4h后逐渐增高，并在感染12h时达到峰值，差异具有统计学意义。收集真菌孢子刺激8h、12h和16h的细胞，进一步用WesternBlot法验证（图3.D），与正常组比在感染真菌8h、12h和16h后细胞中GSDMD-p30的蛋白水平逐渐升高，差异均具有统计学意义。图2.（A-D）感染烟曲霉菌HCECs中GSDMD的表达。（A-B）对GSDMD进行细胞免疫荧光检测，绿色代表GSDMD，蓝色代表DAPI。（C）和（D）分别从mRNA和蛋白水平对GSDMD进行检测。3.小鼠烟曲霉菌性角膜炎中GSDMD的表达3.1小鼠烟曲霉菌性角膜炎的临床观察建立小鼠真菌性角膜炎动物模型，感染后定期裂隙灯下观察角膜的感染情况（图3.A），发现感染真菌1d后结膜开始充血，角膜水肿，感染处见轻度白色混浊，边界
青岛大学硕士学位论文17不清。随时间的延长，角膜混浊逐步加重，渐有溃疡形成至呈现龛样溃疡、穿孔或后弹力层膨出。后随病程的发展，炎症逐渐减轻，溃疡区瘢痕愈合，新生血管长入，最终遗留厚薄不等的瘢痕。临床评分结果也显示（图3.B）,感染后1d临床评分开始逐步升高，5d达到峰值，各组差异均有统计学意义，与裂隙灯下所见结果基本一致。图3.（A-B）小鼠真菌性角膜炎的镜下表现及临床评分。（A）为烟曲霉菌感染小鼠角膜后的裂隙灯照相；（B）为小鼠真菌性角膜炎的对应临床评分。3.2小鼠烟曲霉菌性角膜炎中GSDMD的表达为研究GSDMD是否参与小鼠真菌性角膜炎的免疫过程，收集角膜样本，采用PCR和WesternBlot检测GSDMD的表达。结果显示，与正常组相比，在感染12h后小鼠角膜中的GSDMD的mRNA水平逐渐升高，至第5天达到峰值，差异均有统计学意义，其后至14天，GSDMD表达逐渐下降（图3.A）。WesternBlot结果也显示了，小鼠角膜中的GSDMD-p30的蛋白水平从感染12h后开始增加，至5d达最高峰，差异均有统计学意义，与PCR的变化趋势基本一致（图3.B）。我们进一步使用免疫荧光染色检测正常和烟曲霉感染1d的小鼠角膜中的GSDMD蛋白的表达和定位。正常未感染的小鼠角膜中几乎见不到GSDMD染色（图3.C），而感染1d的小鼠角膜中GSDMD的绿色荧光明显增加，且多表现在角膜的上皮及基质层（图3.D）。
【参考文献】：
期刊论文
[1]Gasdermin D-mediated hepatocyte pyroptosis expands inflammatory responses that aggravate acute liver failure by upregulating monocyte chemotactic protein 1/CC chemokine receptor-2 to recruit macrophages[J]. Hong Li,Xue-Ke Zhao,Yi-Ju Cheng,Quan Zhang,Jun Wu,Shuang Lu,Wei Zhang,Yang Liu,Ming-Yu Zhou,Ya Wang,Jing Yang,Ming-Liang Cheng. World Journal of Gastroenterology. 2019(44)
[2]介导细胞焦亡的杀手蛋白——Gasdermin D[J]. 李楚翎,邵晨烨,刘红兵,宋勇. 医学研究生学报. 2018(04)
[3]Boxb mediate BALB/c mice corneal inflammation through a TLR4/MyD88-dependent signaling pathway in Aspergillus fumigatus keratitis[J]. Min Liu,Cui Li,Gui-Qiu Zhao,Jing Lin,Cheng-Ye Che,Qiang Xu,Qian Wang,Rui Xu,Ya-Wen Niu. International Journal of Ophthalmology. 2018(04)
[4]固有免疫相关模式识别受体研究进展[J]. 何邵平,贺建华,陈佳亿,陈福,欧淑琦. 动物营养学报. 2017(11)
[5]炎性小体激活与细胞焦亡的研究进展[J]. 杨斯迪,邓奇峰,黄瑞,吴淑燕. 微生物与感染. 2017(03)
[6]Review of clinical and basic approaches of fungal keratitis[J]. Jie Wu,Wen-Song Zhang,Jing Zhao,Hong-Yan Zhou. International Journal of Ophthalmology. 2016(11)
[7]真菌性角膜炎研究进展[J]. 孙毅,邓应平. 国际眼科杂志. 2009(05)
[8]我国角膜基础和临床研究的现状及发展[J]. 谢立信. 中华眼科杂志. 2010 (10)
博士论文
[1]真菌感染小鼠角膜过程中菌丝和主要炎症细胞动态变化的研究[D]. 张伟宏.郑州大学 2010
硕士论文
[1]日本血吸虫感染所致肝脏肉芽肿性炎症中的细胞焦亡研究[D]. 林桂莹.广州医科大学 2018
本文编号：3139228
【文章来源】：青岛大学山东省
【文章页数】：59 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
（A-C）烟曲霉菌菌丝及分生孢子形态
结果16图2.（A-B）是对GSDMD进行免疫荧光染色，绿色的代表GSDMD，蓝色的代表DAPI。（A）为在健康人角膜组织中GSDMD的表达；（B）为在确诊为真菌性角膜炎患者的角膜组织中GSDMD的表达。2.2烟曲霉菌刺激人角膜上皮细胞中GSDMD的表达用烟曲霉分生孢子刺激HCECs8h后，采用细胞免疫荧光法处理细胞，检测HCECs中GSDMD蛋白的定位和表达。结果如图显示（图3.A-B），细胞中的GSDMD蛋白在烟曲霉菌刺激后表达明显增加，且主要表达在胞膜和胞质中。收集真菌孢子刺激4h、8h、12h和16h的细胞，用于PCR法检测HCECs中GSDMD的表达变化（图3.C）。观察到GSDMD的mRNA水平从感染真菌4h后逐渐增高，并在感染12h时达到峰值，差异具有统计学意义。收集真菌孢子刺激8h、12h和16h的细胞，进一步用WesternBlot法验证（图3.D），与正常组比在感染真菌8h、12h和16h后细胞中GSDMD-p30的蛋白水平逐渐升高，差异均具有统计学意义。图2.（A-D）感染烟曲霉菌HCECs中GSDMD的表达。（A-B）对GSDMD进行细胞免疫荧光检测，绿色代表GSDMD，蓝色代表DAPI。（C）和（D）分别从mRNA和蛋白水平对GSDMD进行检测。3.小鼠烟曲霉菌性角膜炎中GSDMD的表达3.1小鼠烟曲霉菌性角膜炎的临床观察建立小鼠真菌性角膜炎动物模型，感染后定期裂隙灯下观察角膜的感染情况（图3.A），发现感染真菌1d后结膜开始充血，角膜水肿，感染处见轻度白色混浊，边界
青岛大学硕士学位论文17不清。随时间的延长，角膜混浊逐步加重，渐有溃疡形成至呈现龛样溃疡、穿孔或后弹力层膨出。后随病程的发展，炎症逐渐减轻，溃疡区瘢痕愈合，新生血管长入，最终遗留厚薄不等的瘢痕。临床评分结果也显示（图3.B）,感染后1d临床评分开始逐步升高，5d达到峰值，各组差异均有统计学意义，与裂隙灯下所见结果基本一致。图3.（A-B）小鼠真菌性角膜炎的镜下表现及临床评分。（A）为烟曲霉菌感染小鼠角膜后的裂隙灯照相；（B）为小鼠真菌性角膜炎的对应临床评分。3.2小鼠烟曲霉菌性角膜炎中GSDMD的表达为研究GSDMD是否参与小鼠真菌性角膜炎的免疫过程，收集角膜样本，采用PCR和WesternBlot检测GSDMD的表达。结果显示，与正常组相比，在感染12h后小鼠角膜中的GSDMD的mRNA水平逐渐升高，至第5天达到峰值，差异均有统计学意义，其后至14天，GSDMD表达逐渐下降（图3.A）。WesternBlot结果也显示了，小鼠角膜中的GSDMD-p30的蛋白水平从感染12h后开始增加，至5d达最高峰，差异均有统计学意义，与PCR的变化趋势基本一致（图3.B）。我们进一步使用免疫荧光染色检测正常和烟曲霉感染1d的小鼠角膜中的GSDMD蛋白的表达和定位。正常未感染的小鼠角膜中几乎见不到GSDMD染色（图3.C），而感染1d的小鼠角膜中GSDMD的绿色荧光明显增加，且多表现在角膜的上皮及基质层（图3.D）。
【参考文献】：
期刊论文
[1]Gasdermin D-mediated hepatocyte pyroptosis expands inflammatory responses that aggravate acute liver failure by upregulating monocyte chemotactic protein 1/CC chemokine receptor-2 to recruit macrophages[J]. Hong Li,Xue-Ke Zhao,Yi-Ju Cheng,Quan Zhang,Jun Wu,Shuang Lu,Wei Zhang,Yang Liu,Ming-Yu Zhou,Ya Wang,Jing Yang,Ming-Liang Cheng. World Journal of Gastroenterology. 2019(44)
[2]介导细胞焦亡的杀手蛋白——Gasdermin D[J]. 李楚翎,邵晨烨,刘红兵,宋勇. 医学研究生学报. 2018(04)
[3]Boxb mediate BALB/c mice corneal inflammation through a TLR4/MyD88-dependent signaling pathway in Aspergillus fumigatus keratitis[J]. Min Liu,Cui Li,Gui-Qiu Zhao,Jing Lin,Cheng-Ye Che,Qiang Xu,Qian Wang,Rui Xu,Ya-Wen Niu. International Journal of Ophthalmology. 2018(04)
[4]固有免疫相关模式识别受体研究进展[J]. 何邵平,贺建华,陈佳亿,陈福,欧淑琦. 动物营养学报. 2017(11)
[5]炎性小体激活与细胞焦亡的研究进展[J]. 杨斯迪,邓奇峰,黄瑞,吴淑燕. 微生物与感染. 2017(03)
[6]Review of clinical and basic approaches of fungal keratitis[J]. Jie Wu,Wen-Song Zhang,Jing Zhao,Hong-Yan Zhou. International Journal of Ophthalmology. 2016(11)
[7]真菌性角膜炎研究进展[J]. 孙毅,邓应平. 国际眼科杂志. 2009(05)
[8]我国角膜基础和临床研究的现状及发展[J]. 谢立信. 中华眼科杂志. 2010 (10)
博士论文
[1]真菌感染小鼠角膜过程中菌丝和主要炎症细胞动态变化的研究[D]. 张伟宏.郑州大学 2010
硕士论文
[1]日本血吸虫感染所致肝脏肉芽肿性炎症中的细胞焦亡研究[D]. 林桂莹.广州医科大学 2018
本文编号：3139228
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