鼓室内显微注射慢病毒转染小鼠耳蜗的技术改良
发布时间：2021-06-26 14:27
目的改良经鼓室内显微注射慢病毒转染小鼠耳蜗的实验技术。方法将30只BALB/c小鼠随机分为3组:1μl/min组（12只）和20μl/min组（12只）小鼠经腹侧入路鼓室内分别以1μl/min和20μl/min的速度显微注射5μl的携带绿色荧光蛋白基因的慢病毒（LV3-GFP）,人工外淋巴液组（6只）以1μl/min速度注入等量外淋巴液。于手术前、术后1、3、7天各组动物行听性脑干反应（ABR）测试后,进行耳蜗基底膜铺片荧光染色和耳蜗切片免疫荧光染色,并在激光共聚焦显微镜下观察慢病毒转染情况。结果各组小鼠术后1天ABR阈值均较术前明显升高（P<0.01）,1μl/min组和人工外淋巴液组术后3天ABR阈值恢复正常,20μl/min组术后7天恢复正常。慢病毒转染后,1μl/min组术后1天在耳蜗毛细胞观察到慢病毒阳性表达,术后3天在耳蜗Corti器、螺旋神经节及血管纹处均可见阳性表达;术后1、3、7天耳蜗中回外毛细胞转染率平均为98.3%、98.1%和98.7%,而20μl/min组术后1天未见明显阳性表达,术后1、3、7天耳蜗中回外毛细胞的转染率分别为4.2%、20.2%和47....
【文章来源】：听力学及言语疾病杂志. 2020,28(02)北大核心CSCD
【文章页数】：5 页
【部分图文】：
鼓室内显微注射手术步骤
近年来随着新型载体的出现,内耳基因治疗的研究正在飞速发展。目前临床上常用的内耳导入途径是圆窗膜途径,如:向内耳导入激素、庆大霉素等已被用于治疗突发性聋以及治疗梅尼埃病相关的眩晕[6]。在动物研究中,该途径的手术方法包括鼓室内显微注射和圆窗膜注射法。圆窗膜注射法操作简单,转染效率较高,给予豚鼠圆窗膜显微注射腺相关病毒后,耳蜗基底膜整个区域的毛细胞转染率可高达85%[7]。但由于刺破圆窗膜的损伤较大,采用此法进行转染的小鼠术后听力丧失,2周后才能恢复正常[8]。而鼓室内显微注射法是将病毒载体滴注到完整圆窗膜上,对耳蜗损伤较小,在听功能保护方面具有明显优势。Oishi等[9]发现,小鼠鼓室内注射NOX3 siRNA术后第3天听功能完全恢复正常;而经鼓膜注射的小鼠在同一时间ABR阈值仍明显高于正常。但是,鼓室内注射法耳蜗转染效率较圆窗膜注射法低,且基底膜的转染部位分布不均,以往研究均报道底回转染效率最高,中回和顶回则明显降低[9,10]。图3 1μl/min组小鼠耳蜗的转染效果（a耳蜗铺片荧光染色、b耳蜗切片荧光染色，×630）
图2 实验组耳蜗中回铺片（荧光染色×630）为了发挥鼓室注射法听功能损伤小的优势,进一步提高耳蜗各回(尤其是中回和顶回)的病毒转染效率,本研究从减小听泡开窗面积和减慢液体导入速度两方面,改良了内耳基因导入技术。本研究采用视野开阔的腹侧入路进行手术,不易损伤听骨链,且便于直接观察听泡结构;研究过程中小鼠术后全部存活,这是由于通过面神经、二腹肌和咬肌组成的三角区标志,精准定位了手术入路,使得手术对听泡后壁损伤较小,减少了出血风险。使用牙钻打孔,孔径仅0.45 mm,并且钻孔位置的精确定位,使得在不暴露圆窗龛的情况下完成了慢病毒载体的注射,大大减小了小鼠听泡的开窗面积,比以往报道的开窗面积减少10倍以上[5,9,11]。小鼠鼓室内容积约2 μl,本研究通过微量注射泵可控制液体匀速缓慢注入(1 μl/min),便于鼓室内气体的排出,从而最大限度地减小圆窗膜所受压力,以减轻对小鼠的听力损伤。本研究ABR检测结果显示,1 μl/min组术后3天小鼠听力即完全恢复到正常水平,说明减小开窗和降低注入速度可以减轻鼓室内显微注射手术对小鼠听力的损伤。而如果以本实验中的耳蜗听泡小开窗较大速度(20 μl/min)或是其他研究者报道的大开窗未控制速度(直接滴入)基因转染载体的方式[11],小鼠听力则需7天才能逐渐恢复。
【参考文献】：
期刊论文
[1]经圆窗膜鼓阶显微注射腺相关病毒转染小鼠耳蜗的研究[J]. 陈嘉伟,王卫龙,丁雪瑞,赵倩倩,安晓刚,王人凤,卢连军. 听力学及言语疾病杂志. 2019(03)
[2]9型腺相关病毒经圆窗膜转导小鼠耳蜗两种方式的对比研究[J]. 齐景翠,祖勉,陈妮姗,郭维维,伊海金,杨仕明,余力生. 中华耳科学杂志. 2018(04)
[3]microRNA-146a重组慢病毒载体局部应用治疗免疫介导性内耳病的实验研究[J]. 罗晨曦,李涛,谭长强,黄和. 医学研究生学报. 2016(08)
[4]耳前耳后注射地塞米松及庆大霉素治疗梅尼埃病的疗效观察[J]. 王智勇,苏丽娟,唐强,禹林,蒋中莉,熊玉林,姜浩平,莫明明. 检验医学与临床. 2015(16)
[5]Lentivirus carrying the Atoh1 gene infects normal rat cochlea[J]. Song Pan,Jingzhi Wan,Shaosheng Liu,Song Zhang,Hao Xiong,Jun Zhou,Wu Xiong,Kunfei Yu,Yong Fu. Neural Regeneration Research. 2013(17)
[6]慢病毒载体和腺病毒载体转染原代培养的螺旋神经节细胞的比较[J]. 王国鹏,罗凌惠,谢静,陈沛,付勇,钟刚,龚树生. 临床耳鼻咽喉头颈外科杂志. 2011(04)
本文编号：3251512
【文章来源】：听力学及言语疾病杂志. 2020,28(02)北大核心CSCD
【文章页数】：5 页
【部分图文】：
鼓室内显微注射手术步骤
近年来随着新型载体的出现,内耳基因治疗的研究正在飞速发展。目前临床上常用的内耳导入途径是圆窗膜途径,如:向内耳导入激素、庆大霉素等已被用于治疗突发性聋以及治疗梅尼埃病相关的眩晕[6]。在动物研究中,该途径的手术方法包括鼓室内显微注射和圆窗膜注射法。圆窗膜注射法操作简单,转染效率较高,给予豚鼠圆窗膜显微注射腺相关病毒后,耳蜗基底膜整个区域的毛细胞转染率可高达85%[7]。但由于刺破圆窗膜的损伤较大,采用此法进行转染的小鼠术后听力丧失,2周后才能恢复正常[8]。而鼓室内显微注射法是将病毒载体滴注到完整圆窗膜上,对耳蜗损伤较小,在听功能保护方面具有明显优势。Oishi等[9]发现,小鼠鼓室内注射NOX3 siRNA术后第3天听功能完全恢复正常;而经鼓膜注射的小鼠在同一时间ABR阈值仍明显高于正常。但是,鼓室内注射法耳蜗转染效率较圆窗膜注射法低,且基底膜的转染部位分布不均,以往研究均报道底回转染效率最高,中回和顶回则明显降低[9,10]。图3 1μl/min组小鼠耳蜗的转染效果（a耳蜗铺片荧光染色、b耳蜗切片荧光染色，×630）
图2 实验组耳蜗中回铺片（荧光染色×630）为了发挥鼓室注射法听功能损伤小的优势,进一步提高耳蜗各回(尤其是中回和顶回)的病毒转染效率,本研究从减小听泡开窗面积和减慢液体导入速度两方面,改良了内耳基因导入技术。本研究采用视野开阔的腹侧入路进行手术,不易损伤听骨链,且便于直接观察听泡结构;研究过程中小鼠术后全部存活,这是由于通过面神经、二腹肌和咬肌组成的三角区标志,精准定位了手术入路,使得手术对听泡后壁损伤较小,减少了出血风险。使用牙钻打孔,孔径仅0.45 mm,并且钻孔位置的精确定位,使得在不暴露圆窗龛的情况下完成了慢病毒载体的注射,大大减小了小鼠听泡的开窗面积,比以往报道的开窗面积减少10倍以上[5,9,11]。小鼠鼓室内容积约2 μl,本研究通过微量注射泵可控制液体匀速缓慢注入(1 μl/min),便于鼓室内气体的排出,从而最大限度地减小圆窗膜所受压力,以减轻对小鼠的听力损伤。本研究ABR检测结果显示,1 μl/min组术后3天小鼠听力即完全恢复到正常水平,说明减小开窗和降低注入速度可以减轻鼓室内显微注射手术对小鼠听力的损伤。而如果以本实验中的耳蜗听泡小开窗较大速度(20 μl/min)或是其他研究者报道的大开窗未控制速度(直接滴入)基因转染载体的方式[11],小鼠听力则需7天才能逐渐恢复。
【参考文献】：
期刊论文
[1]经圆窗膜鼓阶显微注射腺相关病毒转染小鼠耳蜗的研究[J]. 陈嘉伟,王卫龙,丁雪瑞,赵倩倩,安晓刚,王人凤,卢连军. 听力学及言语疾病杂志. 2019(03)
[2]9型腺相关病毒经圆窗膜转导小鼠耳蜗两种方式的对比研究[J]. 齐景翠,祖勉,陈妮姗,郭维维,伊海金,杨仕明,余力生. 中华耳科学杂志. 2018(04)
[3]microRNA-146a重组慢病毒载体局部应用治疗免疫介导性内耳病的实验研究[J]. 罗晨曦,李涛,谭长强,黄和. 医学研究生学报. 2016(08)
[4]耳前耳后注射地塞米松及庆大霉素治疗梅尼埃病的疗效观察[J]. 王智勇,苏丽娟,唐强,禹林,蒋中莉,熊玉林,姜浩平,莫明明. 检验医学与临床. 2015(16)
[5]Lentivirus carrying the Atoh1 gene infects normal rat cochlea[J]. Song Pan,Jingzhi Wan,Shaosheng Liu,Song Zhang,Hao Xiong,Jun Zhou,Wu Xiong,Kunfei Yu,Yong Fu. Neural Regeneration Research. 2013(17)
[6]慢病毒载体和腺病毒载体转染原代培养的螺旋神经节细胞的比较[J]. 王国鹏,罗凌惠,谢静,陈沛,付勇,钟刚,龚树生. 临床耳鼻咽喉头颈外科杂志. 2011(04)
本文编号：3251512
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/wuguanyixuelunwen/3251512.html
最近更新
教材专著
