Nrf2与ATF4相互作用在氧化-内质网联合应激中保护人晶状体上皮细胞的机制研究

发布时间：2021-07-26 23:05

　　目的:探索Nrf2（核因子NF-E2相关因子）在过氧化氩（H2O2）诱导的人晶状体上皮细胞（hLEC）氧化-内质网联合应激状态下的保护机制,同时求证Nrf2与ATF4（激活转录因子4）是否在联合应激过程中发生相互作用,为延缓年龄相关性白内障发生发展寻找新的药物靶点。方法:hLEC在400μM H2O2中预培养24h建立联合应激损伤模型,通过细胞转染分别上调、下调hLEC中Nrf2和/或ATF4表达。光镜下分析细胞形态、CCK-8法评估细胞存活率、检测H2O2含量,流式细胞仪检测细胞内活性氧ROS水平。Western Blot检测内质网应激通路蛋白表达程度、RT-PCR在RNA水平同步验证;分离细胞质及细胞核蛋白,检测Nrf2、ATF4及其相关蛋白表达水平、利用免疫共沉淀（Co-IP法）检测转录水平上Nrf2和ATF4相互作用程度。分别检测经过Nrf2或ATF4上调或下调的hLEC在联合应激中细胞总抗氧化能力、谷胱甘肽GSH、超氧岐化酶SOD、过氧化氢酶及各项下游Ⅱ相抗氧化酶表达水平。结果:1.Nrf2增加hLEC在联合应激中存活,降低H2O2和ROS含量。2.H2O2培养诱导内质网应激... 

【文章来源】：中国人民解放军医学院北京市

【文章页数】：70 页

【学位级别】：博士

【部分图文】：

图２?Ｎｒｆ２减弱内质网应激介导的ＵＰＲ信号通路??（Ａ）ＵＰＲ通路蛋白的Ｗｅｓｔｅｍ－ｂｌｏｔ结果

图３Ｃ中ｍＲＮＡ的差异体现转录层面细胞内应对应??激的能力高低，针对ＮＨ２的不同干预Ｎｒｆ２和ｅＩＦ２ａ的ｍＲＮＡ都遵循着“应激越??强、表达越高”的规律

过氧化氢酶（ＣＡＴ）是直接催化细胞中Ｈ２０２的酶类，细胞中过度活跃的活性氧??是干扰细胞氧化平衡的关键因素，与此同时像ＣＡＴ?—类的抗氧化多为直接接受??Ｎｒｆ２的支配参与细胞稳态的维持。图５Ｄ中ＣＡＴ含量在静息状态下是近２０Ｕ／ｍｇ??ｐｒｏｔｅｉｎ（ＮＣ组），遭受Ｈ２０２直接杀伤后含量从６ｈ的１１．６８?Ｕ／ｍｇ?ｐｒｏｔｅｉｎ下降至２４ｈ??的６．０４Ｕ／ｍｇｐｒｏｔｅｉｎ。可以看出Ｈ２Ｏ２的损伤是直接的、即刻的，但Ｎｒｆ２蛋白过??表达处理ｈＬＥＣ后情况发生了改观，在尚未形成损伤的Ｏｈ时刻，细胞内的ＣＡＴ??含量已经收到诱导上升至近３０．０?Ｕ／ｍｇ?ｐｒｏｔｅｉｎ，而在损伤来临后即使ＣＡＴ有所下??降，但是仍显示出增强的抵抗能力。ＡＴＦ４过表达的处理同样能够提高ＣＡＴ的含??量，但效力不及Ｎｒｆ２。??在前期的研究中我们证实Ｎｒｆ２信号通路下游的蛋白中，ＨＯ－１是在细胞抗氧??化体系中重要的抗氧化物酶［２（）］。此次的结果（图５Ｅ）提示在Ｈ２〇２培养的诱导下??ＨＯ－１表达发生上调


本文编号：3304548