蛋白组学分析吸烟对ARMS2/HTRA1高危型RPE细胞的影响及优化干细胞系建立
发布时间：2021-09-22 00:57
目的1、通过基于iTRAQ技术的蛋白质谱分析对吸烟者血清和非吸烟者血清作用于ARMS2/HTRA1高危型及野生型RPE细胞前后蛋白质谱的测定,筛选组间差异蛋白,并对其进行功能和通路富集分析,探究吸烟与ARMS2/HTRA1高危基因型在AMD发病中的作用机制,寻找二者之间关联及影响的直接证据。2、应用CRISPR/Cas9基因编辑技术对干细胞进行靶基因修饰,建立ARMS2高危型、HTRA1高危型纯合优化干细胞系,从而达到将紧密连锁的ARMS2/HTRA1高危基因分开研究的目的,为之后特异性的分析ARMS2以及HTRA1的分子生物学特性,明确AMD真正的致病基因提供了细胞模型。方法1、从预筛选的健康人群分别收集吸烟者血清和非吸烟者血清,探索最佳血清作用浓度。收集角膜移植后的供体眼球,分离培养ARMS2/HTRA1高危型及野生型个体来源的人原代RPE细胞。同时,将ARMS2/HTRA1高危型及野生型个体来源的iPSCs定向诱导分化为iPSCs-RPE细胞。将预混的吸烟者血清和非吸烟者血清分别作用于ARMS2/HTRA1高危型及野生型的原代RPE细胞7天后,提取各实验组的细胞总蛋白,进行基于i...
【文章来源】：天津医科大学天津市 211工程院校
【文章页数】：123 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
显微镜下iPSCs-RPE细胞形态100x(左)，200x(右)
异性标志物 RPE65、ZO-1 进行免疫荧光染色鉴定，之后消化传代及冻存保留细胞株。RPE 细胞呈典型的六边形结构，胞内有色素沉着，RPE65、ZO-1 荧光染色阳性。共计获得眼球 4 个，来源于 4 个不同个体，培养得到 RPE 细胞株 4 株，根据获得捐献眼球的先后顺序分别编号细胞株 NO.1-NO.4。经过比较 20min，25min，30min，35min 四个时间点的差速贴壁法纯化 RPE细胞后，跟其它三个时间点比较，我们发现当差速贴壁时间点为 30min 时，细胞纯化效果更好，获得更多六边形结构的细胞，而且 RPE65 免疫荧光染色的阳性细胞数更多，且呈现出更好的细胞形态，因此，我们筛选出差速贴壁法纯化 RPE细胞的最佳时间点为 30min（图 1.3）。免疫荧光染色显示纯化后的 RPE 细胞表达 RPE 细胞特异性标志物 RPE65、ZO-1（图 1.4）。对上述不同个体来源的 RPE 细胞株进行 ARMS2/HTRA1 基因分型筛选。Sanger 测序结果表明，培养所得的四株原代 RPE 细胞系中，NO.1 和 NO.2 为ARMS2/HTRA1 高危型个体来源，而 NO.3 和 NO.4 为 ARMS2/HTRA1 野生型个体来源。
图 1.4 RPE细胞的形态学特征和免疫鉴定。显微镜下细胞呈规则的六边形形态，呈色素状（左）。RPE 65和ZO-1的免疫荧光染色均为阳性，表明细胞是高度纯化的人RPE细胞（右）。1.2.3 最佳血清作用浓度为 20%根据血清收集条件的筛选，本实验中共收集吸烟人群血清 32 例，非吸烟人群血清 35 例，为最大可能消除个体差异，将多人的吸烟者血清和非吸烟者血清分别混合后，作为后续实验中的应激条件。本实验最佳血清作用浓度条件：最大程度接触血清但不至于使细胞死亡。我们将吸烟者血清、非吸烟者血清和胎牛血清分别按浓度梯度（5%，15%，20%，30%）作用于 RPE 细胞后，通过倒置显微镜观察，细胞计数及 MTT 实验的方法进行检测，发现含 20%血清的培养基作用 7 天是最佳作用条件。显微镜下观察不同浓度吸烟者血清作用 RPE 细胞后形态学变化时发现当细胞暴露于较低的血清浓度时，细胞生长状况稳定，但当血清浓度增加到 30%时，出现许多细胞凋亡漂浮（图 1.5）。细胞计数和 MTT 实验结果同时表明，20%血清浓度是一个转折点。当血清浓度高于 20%时，RPE 细胞的增殖受到抑制，细胞出现凋亡（图 1.6）。
【参考文献】：
期刊论文
[1]肿瘤靶向基因输送载体的研究进展[J]. 张海红,刘永飞. 现代肿瘤医学. 2019(03)
[2]Association between complement factor I gene polymorphisms and the risk of age-related macular degeneration:a Meta-analysis of literature[J]. Qin Wang,Hai-Sheng Zhao,Li Li. International Journal of Ophthalmology. 2016(02)
[3]糖尿病黄斑水肿的发病机制及治疗研究进展[J]. 李琳娜,张晓峰. 临床眼科杂志. 2014(01)
[4]基因转染的虹膜色素上皮细胞移植后RCS鼠视网膜BDNF表达观察[J]. 张英瑜,高朋芬,杨丽霞. 局解手术学杂志. 2011(04)
[5]原发性视网膜色素变性的视网膜移植及基因治疗[J]. 段亚东,付田丽. 第四军医大学吉林军医学院学报. 2002(03)
[6]视网膜色素上皮移植方法的探讨[J]. 李光辉,吴乐正,高汝龙. 中华眼底病杂志. 1997(03)
本文编号：3402831
【文章来源】：天津医科大学天津市 211工程院校
【文章页数】：123 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
显微镜下iPSCs-RPE细胞形态100x(左)，200x(右)
异性标志物 RPE65、ZO-1 进行免疫荧光染色鉴定，之后消化传代及冻存保留细胞株。RPE 细胞呈典型的六边形结构，胞内有色素沉着，RPE65、ZO-1 荧光染色阳性。共计获得眼球 4 个，来源于 4 个不同个体，培养得到 RPE 细胞株 4 株，根据获得捐献眼球的先后顺序分别编号细胞株 NO.1-NO.4。经过比较 20min，25min，30min，35min 四个时间点的差速贴壁法纯化 RPE细胞后，跟其它三个时间点比较，我们发现当差速贴壁时间点为 30min 时，细胞纯化效果更好，获得更多六边形结构的细胞，而且 RPE65 免疫荧光染色的阳性细胞数更多，且呈现出更好的细胞形态，因此，我们筛选出差速贴壁法纯化 RPE细胞的最佳时间点为 30min（图 1.3）。免疫荧光染色显示纯化后的 RPE 细胞表达 RPE 细胞特异性标志物 RPE65、ZO-1（图 1.4）。对上述不同个体来源的 RPE 细胞株进行 ARMS2/HTRA1 基因分型筛选。Sanger 测序结果表明，培养所得的四株原代 RPE 细胞系中，NO.1 和 NO.2 为ARMS2/HTRA1 高危型个体来源，而 NO.3 和 NO.4 为 ARMS2/HTRA1 野生型个体来源。
图 1.4 RPE细胞的形态学特征和免疫鉴定。显微镜下细胞呈规则的六边形形态，呈色素状（左）。RPE 65和ZO-1的免疫荧光染色均为阳性，表明细胞是高度纯化的人RPE细胞（右）。1.2.3 最佳血清作用浓度为 20%根据血清收集条件的筛选，本实验中共收集吸烟人群血清 32 例，非吸烟人群血清 35 例，为最大可能消除个体差异，将多人的吸烟者血清和非吸烟者血清分别混合后，作为后续实验中的应激条件。本实验最佳血清作用浓度条件：最大程度接触血清但不至于使细胞死亡。我们将吸烟者血清、非吸烟者血清和胎牛血清分别按浓度梯度（5%，15%，20%，30%）作用于 RPE 细胞后，通过倒置显微镜观察，细胞计数及 MTT 实验的方法进行检测，发现含 20%血清的培养基作用 7 天是最佳作用条件。显微镜下观察不同浓度吸烟者血清作用 RPE 细胞后形态学变化时发现当细胞暴露于较低的血清浓度时，细胞生长状况稳定，但当血清浓度增加到 30%时，出现许多细胞凋亡漂浮（图 1.5）。细胞计数和 MTT 实验结果同时表明，20%血清浓度是一个转折点。当血清浓度高于 20%时，RPE 细胞的增殖受到抑制，细胞出现凋亡（图 1.6）。
【参考文献】：
期刊论文
[1]肿瘤靶向基因输送载体的研究进展[J]. 张海红,刘永飞. 现代肿瘤医学. 2019(03)
[2]Association between complement factor I gene polymorphisms and the risk of age-related macular degeneration:a Meta-analysis of literature[J]. Qin Wang,Hai-Sheng Zhao,Li Li. International Journal of Ophthalmology. 2016(02)
[3]糖尿病黄斑水肿的发病机制及治疗研究进展[J]. 李琳娜,张晓峰. 临床眼科杂志. 2014(01)
[4]基因转染的虹膜色素上皮细胞移植后RCS鼠视网膜BDNF表达观察[J]. 张英瑜,高朋芬,杨丽霞. 局解手术学杂志. 2011(04)
[5]原发性视网膜色素变性的视网膜移植及基因治疗[J]. 段亚东,付田丽. 第四军医大学吉林军医学院学报. 2002(03)
[6]视网膜色素上皮移植方法的探讨[J]. 李光辉,吴乐正,高汝龙. 中华眼底病杂志. 1997(03)
本文编号：3402831
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