Reep6.1基因功能研究

发布时间：2021-11-03 06:15

　　目的:视网膜色素变性（RP）是一种较常见的遗传眼病,目前尚无有效的临床治疗手段,因此视网膜疾病相关基因及病理机制的研究对疾病预防、诊断及治疗具有重要意义。REEP6是受体表达增强蛋白（receptor expression enhancing protein,REEPs）家族成员,Reep6基因有两种主要形式的异构体,其差异为是否含有5号外显子。目前已有研究证实Reep6基因突变会导致视网膜变性,而包含5号外显子的异构体Reep6.1在视网膜中特异性表达。因此,本论文通过敲除小鼠Reep6.1基因5号外显子,研究Reep6.1基因在视网膜中的功能和基因突变导致视网膜变性的病理变化过程。最终目的是通过综合分析Reep6.1以及其它已报道的视网膜变性相关基因的功能和作用机制等,阐述视网膜变性的疾病发生过程和发病机制并进一步探索潜在的RP治疗方法。方法:利用CRISPR/Cas9技术构建Reep6.1基因5号外显子敲除小鼠模拟人类视网膜色素变性早期症状;采用视网膜电图（ERG）方法检测视网膜功能;用视网膜冰冻切片免疫荧光染色（IHC）和视网膜蛋白免疫印迹（WB）方法分析敲除小鼠的病理组织改变... 

【文章来源】：电子科技大学四川省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：49 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

人眼球和视网膜结构示意图[1]

实验安排

电子科技大学硕士学位论文14本实验利用CRISPR/Cas9基因编辑技术剪切目标基因内含子的DNA，同时提供同源模板Donor，通过DNA的同源重组修复在特定外显子两端插入loxP，同时在5号外显子加入stopcodon，以实现破坏5号外显子翻译的目的，使得Reep6.1特定外显子被删除，从而实现Reep6.1基因5号外显子敲除的目的（如图2-1所示）。小鼠饲养环境：SPF级小动物实验房的独立通风笼具（IVC)系统中，每日光照时长大于8小时，温度25±2℃，湿度40%~50%。每笼饲养4~5只小鼠，每周更换一次垫料，保证小鼠饲料和水源充足，自由取食饮水。每日观察记录小鼠生长及生育情况。图2-1小鼠模型构建原理。（a）条件性敲除小鼠的技术原理；（b）loxP和stopcodon敲入破坏5号外显子翻译的原理2.2.2小鼠基因型鉴定2.2.2.1鉴定样本收集和样本处理1.幼鼠出生2周后，把每只小鼠剪下一个不同位置的脚趾作标记，剪约0.3厘米长度的鼠尾作基因鉴定样本，并编号登记。2.收集剪下的鼠尾和脚趾样本至干净的EP管，每个样本加入70μL动物组织DNA提取液A（40mM的NaOH+0.4mM的EDTA），95℃金属浴中煮30分钟，金属浴中可拿出EP管摇匀，加快组织溶解。3.组织基本溶解完全后，取出冷却至室温，加入70μL动物组织DNA提取液B（40mMTris-HCl）以中和提取液A中的NaOH，混匀。4.处理好的小鼠DNA组织样品即可进行PCR扩增。将样本置于－20℃冰箱则可保存较长时间。

【参考文献】：
期刊论文
[1]视网膜色素变性分类的研究进展[J]. 邢怡桥,黄蓉,李敏.  临床眼科杂志. 2017(02)



本文编号：3473209