从小鼠视网膜多种成像方式探讨眼科光学成像技术进展

发布时间：2021-12-08 22:33

　　鉴于动物研究在基础研究中的重要作用,近年来几种在人眼视网膜成像中广泛应用的光学成像技术也在动物视网膜中得到了成功应用,无需组织学切片即可实现对动物视网膜的高精度细胞级别成像,这为使用动物视网膜进行基础研究的科研工作者提供了强有力的工具。与之相应的是,动物视网膜的研究工作中也开发了一些新型的、可以应用于人眼的成像技术,或者增强了对人眼视网膜功能机理的理解。结合自身在小鼠视网膜多种活体成像方式上的技术积累和研究经历,从若干方面阐述了近年来在小鼠和人眼视网膜高精度光学成像领域出现的技术突破,侧重于展示当前技术所能达到的成像水平,希望能起到抛砖引玉的效果,为促进动物视网膜影像和人眼视网膜影像之间的相互交流和相互促进起到积极的作用。 

【文章来源】：中国激光. 2020,47(02)北大核心EICSCD

【文章页数】：28 页

【部分图文】：

小鼠眼球与人类眼球的对比。(a)人眼示意图[21];(b)小鼠眼球示意图[21];

因为光线必须要经过角膜和晶状体,因此视网膜活体成像需要考虑眼睛光学系统对成像光路的影响。简单来讲,可以把光路分为入射光路和出射光路,如图3(a)所示,如果入射光为会聚光,那么入射光经过眼睛光学系统后变为发散光从而覆盖较大部分的视网膜,从视网膜每一点散射回来的光线经过眼睛的光学系统后变为平行光,因此需要面阵的接收器件,如CCD或者CMOS来收集这些光线并将其转化成图像信号,这即为眼底相机的工作原理[图3(b)]。眼底相机起源于20世纪前半叶[34-35],最早于1925年由德国的卡尔·蔡司公司研制出来,经过多年的持续优化与改进,目前已发展出多种形式,包括最为常见的台式设备和近年来兴起的手持式设备,这些设备可以对视网膜的血管网络进行宽视场观察与彩色成像,成为临床诊断的重要参考。小鼠视网膜眼底照相技术起源于20世纪90年代[36-37],通常具有反射光和荧光成像等模态,如图4(a)～(c)所示,其主要特点是系统简单、速度快、成本低,实际应用中,为了避免角膜中心的反射光线,通常将其入射光路设计为环形,如图3(a)中插图i所示,亦有通过巩膜进行照明的研究,如图3(a)中插图ii所示[38-39]。但是因为亮视场照明和成像时,视网膜上所有反射光均被相机采集,造成图像对比度较低[图4(a)、(b)],且通常其视场和像素固定,无法随需修改,即使经数字放大和平均后对成像细节的改善也很有限[图4(c)、(d)]。20世纪80年代研究人员发明了基于激光点扫描的检眼镜技术(SLO)[40-41],尽管现在的SLO通常使用宽带光源而不是激光,如超辐射二极管(SLD)等来降低成像散斑噪声,其方法的本质是一样的,因此使用SLO来统称这一类技术。若只考虑入射光线和出射光线[图3(a)中插图iii和图3(c)],SLO使用平行光作为入射光线,其经眼睛的光学系统后在视网膜上会聚为一点,经视网膜组织散射后的出射光线经晶状体准直为平行光。因为出射光线只携带视网膜上单个像素点的反射信息,因此需要选用点探测器来进行光电图像转换,如光电倍增管(PMT)等。使用点扫描技术进行成像的一个好处是:可以通过控制扫描范围或者调整扫描点数量来对感兴趣的区域实现高密度的采样,从而得到清晰的图像[图4(e)～(h)];更重要的是,其可以与共聚焦技术相结合,通过在与像平面共轭的焦点处添加一个小孔[图3(c)]来选择性地收集反射光,这不仅消除了焦点之外的光线,增强了图像的对比度[图4(e)～(f)],也使得SLO具有一定的层切能力,可以实现对视网膜轴向不同部分的成像。因此,SLO的本质是一个应用在视网膜活体成像上的激光扫描共聚焦显微镜,其可加装各种荧光探针,或者集成双光子等高级成像技术,实现亚细胞级别的活体成像。图3(a)中插图iv是近年来新开发的基于斜入射光的倾角激光扫描检眼镜技术[42]。

20世纪80年代研究人员发明了基于激光点扫描的检眼镜技术(SLO)[40-41],尽管现在的SLO通常使用宽带光源而不是激光,如超辐射二极管(SLD)等来降低成像散斑噪声,其方法的本质是一样的,因此使用SLO来统称这一类技术。若只考虑入射光线和出射光线[图3(a)中插图iii和图3(c)],SLO使用平行光作为入射光线,其经眼睛的光学系统后在视网膜上会聚为一点,经视网膜组织散射后的出射光线经晶状体准直为平行光。因为出射光线只携带视网膜上单个像素点的反射信息,因此需要选用点探测器来进行光电图像转换,如光电倍增管(PMT)等。使用点扫描技术进行成像的一个好处是:可以通过控制扫描范围或者调整扫描点数量来对感兴趣的区域实现高密度的采样,从而得到清晰的图像[图4(e)～(h)];更重要的是,其可以与共聚焦技术相结合,通过在与像平面共轭的焦点处添加一个小孔[图3(c)]来选择性地收集反射光,这不仅消除了焦点之外的光线,增强了图像的对比度[图4(e)～(f)],也使得SLO具有一定的层切能力,可以实现对视网膜轴向不同部分的成像。因此,SLO的本质是一个应用在视网膜活体成像上的激光扫描共聚焦显微镜,其可加装各种荧光探针,或者集成双光子等高级成像技术,实现亚细胞级别的活体成像。图3(a)中插图iv是近年来新开发的基于斜入射光的倾角激光扫描检眼镜技术[42]。光学相干层析(OCT)技术是20世纪90年代发展起来的基于短相干光源干涉成像的一种技术[43],通常使用SLD、超连续谱光源(Supercontinuum Laser)或者扫频光源(Swept Source)等。与SLO类似,主流的OCT技术亦是基于点扫描逐点成像,平行的入射光经眼睛成像系统聚焦到视网膜上,其反射光线经晶状体准直后与参考臂光线干涉并由光谱仪或者光电探测器记录其信号,进一步通过傅里叶变换提取出深度方向的反射信息[图3(a)中插图v和图3(d)],因此非常适合对多层结构的视网膜进行三维成像[图4(i)～(j)]。对比图4(e)和(i),可以看出,OCT利用相干门(Coherent Gate)进一步消除了系统中来自透镜表面的背反射光(图像无中心亮斑)。OCT自发明以来,获得了高速的发展,尤其是从时域[43-44]到频域[45-47]的突破,使得OCT在成像速度、灵敏度和信噪比等方面均得到了大幅提高[48-49],而扫频OCT则在维持高灵敏度和信噪比的情况下进一步提高了成像速度[50]。作为对比,文献报道的时域OCT速度可达8 kHz[51];而单个CCD光谱仪的频域OCT则可达到312.5 kHz[52];若使用多个光谱仪,其速度可达1 MHz[53];扫频OCT则可以实现数MHz以上的扫描速度[54-56]。近年来最大的突破是OCT血管造影术[OCTA,图4(k)～(l)][57-58],其可通过多种方式实现[59-63],以Phase-variance方法为例[60],该方法通过在同一位置处进行多次重复扫描得到多张OCT B-scan图像,通过提取出单个像素上的相位变化方差实现对血管网络的提取,如图4(j)所示,血管处快速的血流造成了与血管对应的像素相位不停变化,从而通过相位变化方差识别出血流信息。OCT的三维分辨能力可以将不同轴向位置的血管网络提取出来,图4(k)～(l)分别显示了视网膜血管和脉络膜血管,其图样截然不同,为研究不同层的血管结构变化提供了便利。临床上也进行了大量的研究工作以比较OCTA与传统的荧光造影的优缺点[64-65],尽管OCTA无法识别如糖尿病性眼病带来的毛细血管破裂、泄漏导致的慢速血流信号,其无需造影剂即可对血管三维网络进行高精度成像的优势,使得OCTA成为眼科研究与临床疾病诊断的一个强有力的工具,在脑组织[66]、皮肤[67]等其他血管丰富的领域也得到了广泛的应用。

【参考文献】：
期刊论文
[1]Developing a contact probe for rodent fundus imaging in a confocal scanning laser ophthalmoscope[J]. 江晓芸,丁翼晨,王文耀,黄智宇,王志茹,Elie de Lestrange Anginieur,俞玥,李军,濮鸣亮,任秋实,李长辉.  Chinese Optics Letters. 2016(03)



本文编号：3529370