HDAC2对豚鼠急性听力损失治疗中糖皮质激素抵抗影响的研究

发布时间：2017-05-18 01:09

  本文关键词：HDAC2对豚鼠急性听力损失治疗中糖皮质激素抵抗影响的研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：实验目的：糖皮质激素(Glucocorticoid, GC)在内耳中的应用有60多年的历史,广泛应用于突发性聋、自身免疫性内耳疾病、梅尼埃病等内耳疾病中。GC也应用于一些其他的内耳炎症性疾病如细菌性中耳炎、脑膜炎、败血症等造成感音神经性聋中。大量的临床研究表明GC治疗耳聋及前庭疾病疗效显著,但也有研究表明GC治疗效果不明显,存在GC不敏感及GC抵抗。最近的研究发现,组蛋白的乙酰化水平升高,组蛋白去乙酰化酶2(histone deacetylase 2,HDAC2)表达及活性下降是GC抵抗的主要机理。我们前期研究发现突聋患者中GC疗效跟HDAC2活性呈正相关。近来有研究表明氧化应激、炎症可导致HDAC2的下降,从而降低靶细胞对GC的敏感性。本研究通过向豚鼠鼓阶注射脂多糖(lipopolysaccharide, LPS),造成实验动物急性内耳炎症,同时给予HDAC2的激活剂氨茶碱(aminophylline,AMI)改变HDAC2的活性／含量,观察GC的疗效。研究方法：选择50只健康白色豚鼠,随机分成5组,每组10只：对照／人工外淋巴液(artificial perilymph, AP)组：行鼓阶微量注射术,双耳鼓阶均注射AP,其他无特殊处理。其他四组均鼓阶注射5mg/ml的LPS：模型(LPS)组：无其他特殊处理；地塞米松(LPS+DEX)组：术前及术后24小时腹腔注射1mg/kg地塞米松；氨茶碱(LPS+AMI)组：术前及术后24小时腹腔注射20mg/kg氨茶碱；地塞米松+氨茶碱(LPS+DEX+AMI)组：术前及术后24小时腹腔注射1mg/kg地塞米松和20mg/kg氨茶碱。所有动物给药前检测听性脑干反应(auditory brainstem response, ABR),选择听力正常的动物作为实验对象。术后48小时检测豚鼠ABR,观察豚鼠听力的变化。HE染色观察内耳结构改变,采用免疫荧光结合荧光显微镜的方法,观察豚鼠基底膜铺片及耳蜗组织冰冻切片中HDAC2的分布及空间定位。用酶联免疫吸附试验(ELISA)法测定耳蜗组织中HDAC2的含量。结果：ABR检测显示,LPS造成全频率听力损失,其中高频区听力损失最严重,平均阈移在60dB左右；与AP组相比,LPS组各个频率均有显著的听力损失(p0.01)。LPS+DEX组及LPS+AMI组听力较LPS组在频率16k、32k处听力改善明显(p0.05)。LPS+DEX+AMI组疗效最好,在各个频率均优于单独使用地塞米松治疗(p0.05),以频率在16k处最显著(p0.01)。HE染色见LPS组内耳结构严重破坏,血管纹变薄,螺旋韧带与耳蜗外侧壁分离,螺旋神经细胞核皱缩,单独使用DEX及AMI,内耳结构较LPS组破坏减轻,联合DEX及AMI仅有轻度损伤。基底膜铺片及切片结果表明HDAC2广泛分布于耳蜗中,包括内外毛细胞、支持细胞、血管纹、螺旋神经元等区域,和4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole, DAPI)位置一致,提示HDAC2在耳蜗中广泛表达,且存在于胞核内。ABR阈移在8k、16k、32k处与耳蜗内HDAC2的表达呈负相关(p0.05)。结论：本实验中通过鼓阶直接注射5ul 5mg/ml的LPS,造成实验动物重度感音性聋,高频区听力损失最严重。耳蜗注射LPS产生急性炎症,与AP组相比,HDAC2含量降低,提示内耳中炎症可引起HDAC2的下降。给予DEX全身应用疗效不显著,仅在频率为16k、32k处有统计学意义(p0.05),提示存在GC不敏感及抵抗。而GC联合AMI组治疗效果最显著。有研究表明低剂量的茶碱可以提高HDAC2的活性,从而通过磷脂酰肌醇3-激酶(Phosphatidyl Inositol 3-kinase, PI3K)途径,抑制炎症基因的表达。本实验中LPS+AMI+DEX组中,HDAC2表达又有所恢复,GC疗效提高,提示AMI可提高HDAC2的含量,改善GC抵抗状态。因此,本实验表明AMI可提高HDAC2的表达,从而提高GC对LPS诱导的急性炎症导致的感音性聋的疗效。通过提高HDAC2的活性或(和)含量,改善GC抵抗的状态,为内耳疾病GC抵抗患者的治疗提供了新思路。
【关键词】：组蛋白去乙酰化酶2 糖皮质激素抵抗 听力损失 氨茶碱 豚鼠
【学位授予单位】：南京大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R764
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-9
• 本文主要的英文缩略词对照表9-12
• 第一章 前言12-14
• 第二章 实验材料与方法14-23
• 2.1 实验对象14
• 2.2 实验试剂14-15
• 2.3 主要仪器设备15
• 2.4 动物实验步骤15-23
• 2.4.1 实验动物分组15
• 2.4.2 内耳炎症动物模型构建15-16
• 2.4.3 ABR检测16
• 2.4.4 耳蜗HE染色16-18
• 2.4.5 耳蜗基底膜铺片18
• 2.4.6 耳蜗冰冻切片制作及免疫荧光染色18-19
• 2.4.7 HDAC2表达检测19-21
• 2.4.8 动物实验技术路线图21-22
• 2.4.9 统计分析22-23
• 第三章 实验结果23-30
• 3.1 ABR结果分析23-24
• 3.2 耳蜗形态结构观察24-26
• 3.3 HDAC2在内耳中的表达及空间定位26-27
• 3.4 耳蜗组织HDAC2蛋白表达水平27-28
• 3.5 ABR阈移与耳蜗组织中HDAC2表达相关性分析28-30
• 第四章 讨论30-35
• 4.1 内耳疾病存在炎症30
• 4.2 糖皮质激素在内耳疾病中的应用30-32
• 4.3 HDAC2在糖皮质激素抵抗中的作用32-33
• 4.4 氨茶碱的抗炎作用及与HDAC2关系的研究进展33-35
• 第五章 结论35
• 参考文献35-40
• 第六章 文献综述40-53
• 参考文献46-53
• 攻读硕士期间发表论文53-54
• 致谢54-56

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