氧化应激在间歇低氧致海马神经细胞损伤中自噬变化的机制研究

发布时间：2017-07-05 12:01

  本文关键词：氧化应激在间歇低氧致海马神经细胞损伤中自噬变化的机制研究

  更多相关文章： 阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征 海马神经细胞 间歇低氧 氧化应激 自噬 细胞凋亡 N-乙酰半胱氨酸

【摘要】：目的阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征(OSAHS)是最常见的睡眠呼吸障碍,神经认知功能障碍是其常见的并发症之一。其发生可能与OSAHS的特征性病理生理学改变间歇低氧有关。间歇低氧可导致大脑海马区神经细胞不同程度损伤,如细胞凋亡、炎性损伤等。自噬作为真核细胞中广泛存在的降解/再循环系统,与缺血/缺氧所致的细胞损伤存在一定的联系。我们前期研究已证实自噬可能同样参与了间歇低氧所致的海马神经细胞损伤,但其机制尚不清楚。氧化应激被认为是间歇低氧所致各系统损伤的病理机制之一,也是细胞应激状态下诱导自噬产生的重要原因。因此,我们推测氧化应激可能介导了间歇低氧致海马神经细胞损伤中自噬的变化。本研究即通过模拟OSAHS建立间歇低氧模型,从体外水平研究观察间歇低氧及抗氧化干预对海马神经细胞自噬强度、活性氧水平及细胞损伤程度的影响,探讨氧化应激在间歇低氧致海马神经细胞损伤中自噬发生变化的作用及机制。方法取出生24h内的SD乳鼠,分离海马组织,接种细胞悬液进行原代海马神经细胞培养,通过光学显微镜分别观察细胞培养第1、3、5、7天海马神经细胞的形态学改变。①将细胞随机分为4组:正常对照组、间歇低氧4h组、间歇低氧8h组、间歇低氧12h组,应用间歇低氧模式(循环给予:常氧为21%O2,5%CO2和平衡N2,持续10min;低氧为1.5%O2,5%CO2和平衡N2,持续5min,一次循环15min)处理各间歇低氧组海马神经细胞,建立4h、8h、12h三个时间点的间歇低氧细胞模型,正常对照组持续给予21%的常氧。通过免疫荧光法检测海马神经细胞膜标记蛋白MAP-2的表达,进行原代海马神经细胞鉴定。通过免疫印迹法和免疫荧光法检测各组海马神经细胞自噬标记蛋白LC3-II、Beclin1的表达,DCF免疫荧光法检测各组海马神经细胞ROS水平,TUNEL法检测各组海马神经细胞凋亡率;②将细胞随机分为4组:正常对照组、间歇低氧组、抗氧化干预组、间歇低氧+抗氧化干预组,给予细胞N-乙酰半胱氨酸(NAC)抗氧化干预处理,选取ROS及自噬表达变化最明显的间歇低氧时间点12h进行间歇低氧处理,建立N-乙酰半胱氨酸(NAC)抗氧化干预的间歇低氧细胞模型,正常对照组及单纯抗氧化干预组分别持续给予21%的常氧。通过免疫印迹法和免疫荧光法检测各组海马神经细胞自噬标记蛋白LC3-II及cleaved-caspase-3的表达,DCF免疫荧光法检测各组海马神经细胞ROS水平,TUNEL法检测各组海马神经细胞凋亡率。结果①原代海马神经细胞培养的光镜观察图与鉴定:光镜下可见第1天细胞出现分支及双极突起,第3天细胞胞体增大,突起向外延伸,部分细胞聚集成簇生长,至第5-7天,细胞胞体成熟饱满,突起粗壮可交织成网;免疫荧光检测MAP-2结果显示,海马神经细胞其胞体和突起呈现MAP-2表达的红色荧光。②间歇低氧不同时间点海马神经细胞自噬、ROS表达及凋亡的检测:免疫印迹及免疫荧光法检测结果显示,随着间歇低氧时间延长,自噬标记蛋白LC3-II、Beclin1的表达也逐渐增高,间歇低氧12h组表达较正常对照组显著增高,差异具有统计学意义(P0.05);DCF免疫荧光法检测结果显示,随着间歇低氧时间延长,海马神经细胞ROS表达也逐渐增高,间歇低氧12h组表达较正常对照组显著增高,差异具有统计学意义(P0.05);TUNEL法检测结果显示,随着间歇低氧时间延长,细胞凋亡率也逐渐增高,间歇低氧12h组较正常对照组显著增高,差异具有统计学意义(P0.05)。③抗氧化干预间歇低氧处理后海马神经细胞自噬、ROS表达及凋亡的检测:免疫印迹及免疫荧光法检测结果显示,间歇低氧组自噬标记蛋白LC3-II的表达较正常对照组显著增高,间歇低氧+抗氧化干预组自噬标记蛋白LC3-II的表达较间歇低氧组显著降低,差异具有统计学意义(P0.05);DCF免疫荧光法检测结果显示,间歇低氧组海马神经细胞ROS表达较正常对照组显著增高,间歇低氧+抗氧化干预组ROS表达较间歇低氧组显著降低,差异具有统计学意义(P0.05);免疫印迹法检测结果显示,间歇低氧组cleaved-caspase-3的表达较正常对照组显著增高,间歇低氧+抗氧化干预组cleaved-caspase-3的表达较间歇低氧组显著降低,差异具有统计学意义(P0.05);TUNEL法检测结果显示,间歇低氧组海马神经细胞凋亡率较正常对照组显著增高,间歇低氧+抗氧化干预组细胞凋亡率较间歇低氧组显著降低,差异具有统计学意义(P0.05)。结论本研究证实:①ROS可能参与了间歇低氧诱导的海马神经细胞自噬的改变;②抗氧化干预可减轻间歇低氧诱导的海马神经细胞自噬以及细胞凋亡。综上所述,氧化应激介导了间歇低氧诱导的海马神经细胞自噬的改变,而且氧化应激介导的自噬可能加重了间歇低氧诱导的海马神经细胞凋亡。
【关键词】：阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征 海马神经细胞 间歇低氧 氧化应激 自噬 细胞凋亡 N-乙酰半胱氨酸
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R766
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 缩略语/符号说明10-12
• 前言12-15
• 研究现状、成果12-14
• 研究目的、方法14-15
• 1 对象和方法15-28
• 2 结果28-39
• 3 讨论39-45
• 4 小结45-46
• 结论46-47
• 参考文献47-54
• 发表论文和参加科研情况说明54-56
• 综述56-67
• 综述参考文献63-67
• 致谢67

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本文编号：521836