诱导多能干细胞株的建立及过表达抗凋亡基因Bcl-2的iPSCs构建

发布时间：2017-07-13 15:11

  本文关键词：诱导多能干细胞株的建立及过表达抗凋亡基因Bcl-2的iPSCs构建

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【摘要】：研究背景感音神经性耳聋主要是由毛细胞、螺旋神经节的衰亡所致,哺乳动物的耳蜗细胞在出生后丧失再生修复能力,在受到耳毒性药物、感染、噪音等严重创伤后,内耳细胞可能发生变性,甚至坏死、凋亡,听力将不可逆性下降。干细胞耳蜗植入作为内耳疾病的一种治疗手段,有望实现毛细胞、螺旋神经节的再生修复,从而重建听力。诱导多能干细胞(iPSCs),是将体细胞重编程为类似胚胎干细胞的一类具有多能性的干细胞,可以作为细胞治疗的供体,并已在多个领域产生极好的效果。然而内耳移植环境的损伤状态、干细胞移植存活率低下一直是内耳再生修复领域的两大困扰,是否可以通过以干细胞治疗为基础,结合基因干预的手段,同时解决上述两个问题。基于以上情况,我们展开了如下研究。目的构建尿液来源的诱导多能干细胞,为内耳疾病的治疗提供候选细胞；构建过表达抗凋亡基因Bcl-2的iPSCs,为实现内耳疾病细胞、基因联合治疗模式的探究提供前期准备。方法获取来自正常人的尿液样本,通过经典的四因子0ct4, Sox2, c-myc和Klf4途径诱导多能干细胞并完成其多能性验证；通过构建携带Bcl-2抗凋亡基因的慢病毒,感染iPSCs,验证过表达Bcl-2对其生存、分化及全能性的影响,并测定过表达Bcl-2的iPSCs诱导的神经元的神经营养因子分泌水平。结果1.完成了尿液来源的正常人iPSCs的构建1.1分离、获得正常人的尿液来源的上皮细胞系,细胞呈纤维样、上皮样,且分裂增殖速度快,状态良好。1.2四因子诱导的iPSCs细胞株建立,克隆呈类圆形,边界清晰、锐利,克隆内细胞均一、核大、排列致密,且核质比高。1.3碱性磷酸酶活性呈强阳性；SSEA4、TRA-1-60、TRA-1-81、0CT4、NANOG等抗原呈阳性表达；内源性ES标志性基因0CT4、S0X2、KLF4、NANOG能激活并表达；外源性基因0ct4, Sox2, c-myc和Klf4均整合入iPSCs基因组,但均未被表达激活；拟胚体、畸胎瘤形成实验均鉴定阳性。检测证实构建的iPSCs具有全能性,且无致癌基因c-Myc的表达。2.成功构建了过表达Bcl-2抗凋亡基因的iPSCs2.1构建携带Bcl-2的重组慢病毒。2.2构建过表达Bcl-2的iPSCs,并验证其存活,拟胚体形成、神经元的分化能力均不受影响。2.3过表达Bcl-2的iPSCs诱导的神经元,BDNF、NT3水平显著提高,而NGF的表达水平无明显改变。结论1.人的尿液中可以获得分裂、增殖能力良好的上皮细胞。2.经尿液来源的上皮细胞诱导的iPSCs细胞株具有分化全能性。3.Bcl-2基因可以通过重组慢病毒构建,且能感染iPSCs细胞。4.过表达Bcl-2抗凋亡基因的iPSCs,其存活、分化、多能性无明显差异。5.过表达Bcl-2的iPSCs诱导的神经元细胞,BDNF、NT3等神经营养因子的分泌水平提高,NGF无明显差异。
【关键词】：诱导多能干细胞 Bcl-2家族蛋白 感音神经性耳聋 细胞治疗 基因治疗
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R764.43
【目录】：

• 致谢4-5
• 中文摘要5-8
• 英文摘要8-11
• 本课题中使用到的主要仪器11-12
• 主要试剂的配制12-14
• 英文缩写注释14-16
• 1 前言16-20
• 2 材料与方法20-31
• 2.1 实验材料20
• 2.2 标本收集20-21
• 2.3 诱导多能干细胞株建立、鉴定21-27
• 2.4 过表达Bcl-2的iPSCs构建27-31
• 3 结果31-39
• 4 讨论39-43
• 5 结论43-44
• 参考文献44-50
• 综述50-61
• 参考文献56-61
• 个人简历61

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本文编号：537377