耳部术腔上皮缺损组织工程学修复的基础研究

发布时间：2017-07-17 07:06

  本文关键词：耳部术腔上皮缺损组织工程学修复的基础研究

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【摘要】：耳部病变,例如耳部肿瘤、中耳胆脂瘤、外伤、先天性畸形等手术去除病变后可遗留局部皮肤缺损,形成的颞骨裸露骨面需要修复。研究发现,仍有3%-40%的患者术后上皮化进展缓慢或上皮化不全。组织液从骨壁渗透到中耳或乳突腔可引起细菌感染和肉芽组织增生,易于形成瘢痕组织,或造成术腔狭窄。临床上通常使用皮肤、骨膜瓣、骨粉、颞骨筋膜或者脂肪修复,也有部分同种异体或异种移植物。尽管这些修复材料的应用取得了一定的疗效,但是部分再次手术病人则存在供区损伤或组织数量不足的问题,目前仍未找到一种理化性质稳定、便于细胞定植,能支持颞骨皮肤结构与功能恢复的上皮修复材料,以及相关的技术方法与手段。本文旨在应用组织工程原理与技术将细胞和支架材料相结合,探索通过生物制造方法,构建组织工程化皮肤,替代和修复耳部术腔和颞骨创面皮肤。研究目的(1)建立体外分离培养脂肪间充质干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)的方法,并观察其形态及生物学特性,探讨其作为耳部术腔上皮组织工程种子细胞的可行性。(2)构建脂肪间充质干细胞聚合物(adipose-derived stem cell aggregates,ADSC aggregates)-细胞外基质(extracellular matrix,ECM)复合物补片(ADSC aggregates-ECM),观察ADSCs在ECM支架上复合培养时的生长状况,并探讨ECM作为组织工程支架材料的可行性。(3)构建新西兰兔耳廓和外耳道的皮肤缺损模型,并采用复合物补片和单纯ECM支架两种方式修复创面,比较两种方式修复创面愈合情况及炎症状况,探讨复合物补片促进创面愈合的作用和机制。研究方法(1)优化Zuk分离、纯化和培养ADSCs的方法,采用诱导多向分化、鉴定表面分子、绘制生长曲线等方法进行干细胞生物特性验证。(2)接种ADSCs于ECM支架上,采用扫描电镜、激光共聚焦显微镜、流式细胞术观察ADSCs在ECM支架上形成聚合物状况;RT-PCR技术检测ADSCs培养时自分泌活性因子情况。(3)采用手术剪除和打孔的方法建立新西兰兔耳廓和外耳道全层皮肤创伤模型。两种模型均随机分为3组,分别将复合物补片及单纯ECM支架移植入创面,设立空白对照组,分别于第2、4、7周在体和组织学观察3组术区的渗液、肉芽组织增生和感染情况,并计算创面愈合率;于第1、2周提取创面新生组织的蛋白,进行Western Blot检测,对比不同移植组促组织愈合的新生因子分泌情况。研究结果(1)ADSCs形态均一、呈纤维细胞样生长,具有成脂、成骨分化潜能。流式检测ADSCs高表达CD29,CD90,低表达CD14,CD45。细胞有明显的指数生长期。(2)ADSCs在ECM支架表面具有较好的粘附性,重叠生长,细胞间紧密连接,未出现大量凋亡。且ADSCs在ECM支架上分泌HGF、TGF-β、b FGF、EGF功能明显高于无支架组(P0.05)。(3)在外耳道创面模型中,术后第4周,ADSC aggregates-ECM组较ECM组、对照组上皮愈合更近似周边组织,HE染色发现ADSC aggregates-ECM组较其他两组能形成正常的上皮类似结构。(4)在第1周和第2周,ADSC aggregates-ECM组和ECM组缺损部位分泌的b FGF EGF,HGF,VEGF和TGF-β1显著高于对照组。(5)耳廓创面模型中,术后第2周,ADSC aggregates-ECM组创面愈合率明显高于ECM组和对照组。组织学HE染色发现:对照组较另外两组创面浸润大量炎性细胞。第4周,三组创面皮肤均愈合,炎性细胞减少。第7周,三组创面瘢痕逐渐减退。ADSC aggregates-ECM组和ECM组瘢痕厚度均低于对照组(p0.05)。研究结论(1)体外培养的兔ADSCs具有间充质干细胞特性,可作为耳部术腔上皮组织工程种子细胞。(2)ECM支架为细胞的生长、爬行提供了良好的微环境。同时对于细胞表达多种生长因子有更好的促进作用。是一种具有潜在应用价值的组织工程支架材料。(3)移植到创面后,ADSC aggregates ECM和单纯的ECM支架均有利于耳部创面的愈合,且ADSC aggregates ECM能降低创伤后炎症反应强度,促进创面愈合,减小瘢痕厚度,效果优于单纯的ECM支架组和空白对照组。本研究为修复耳部术后的颞骨上皮缺损提供了有意义的实验依据。
【关键词】：耳部 组织工程 上皮修复 脂肪间充质干细胞 细胞外基质 共培养
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R764.9
【目录】：

• 中英文缩略词表9-12
• 中文摘要12-15
• Abstract15-19
• 前言19-23
• 第一部分 种子细胞分离培养和鉴定23-30
• 1 引言23
• 2 实验材料23-24
• 2.1 实验动物23
• 2.2 主要试剂23-24
• 2.3 主要仪器24
• 3 实验方法24-26
• 3.1 腹部脂肪的取材24
• 3.2 ADSCs的原代培养24
• 3.3 ADSCs的传代培养24-25
• 3.4 ADSCs的多向分化能力鉴定25
• 3.4.1 成脂诱导25
• 3.4.2 成骨诱导25
• 3.5 ADSCs表面抗原检测25-26
• 3.6 ADSCs增殖26
• 4 实验结果26-27
• 4.1 ADSCs形态学观察26-27
• 4.2 ADSCs分化潜能鉴定27
• 4.3 ADSCs表面抗原检测27
• 4.4 ADSCs生长曲线测定27
• 5 讨论27-30
• 第二部分 ADSC aggregates-ECM复合物培养30-40
• 1 引言30
• 2 实验材料30-31
• 2.1 支架材料30
• 2.2 主要试剂30
• 2.3 主要仪器30-31
• 3 实验方法31-35
• 3.1 ECM的HE染色31-32
• 3.2 ADSC aggregates-ECM复合物构建32
• 3.3 ADSC aggregates-ECM复合物检测32-35
• 3.3.1 SEM观察ADSCs粘附性及成聚合物状态32
• 3.3.2 激光共聚焦显微镜观察ADSCs在ECM上活性和凋亡情况32-33
• 3.3.3 流式细胞分析ADSCs在ECM上生长周期情况33
• 3.3.4 细胞因子表达的检测33-35
• 3.3.4.1 ADSCs和复合物总RNA的提取33-34
• 3.3.4.2 ADSCs和复合物c DNA的反转录34
• 3.3.4.3 RT-PCR检测34-35
• 3.3.4.4 统计35
• 4 结果35-36
• 4.1 ECM形态学观察35
• 4.2 ADSCs在ECM中培养和形态学观察35-36
• 4.3 ADSCs在ECM中凋亡情况36
• 4.4 ADSCs在ECM中生长周期情况36
• 4.5 ADSCs在ECM中细胞因子和蛋白表达量的比较36
• 5 讨论36-40
• 5.1 支架的选择36-38
• 5.2 ECM支架对ADSCs的影响38
• 5.3 细胞与支架表层界面的相互作用38-40
• 第三部分 ADSC aggregates -ECM修复兔急性皮肤创面效果的体内检测40-56
• 1 引言40
• 2 实验材料40-41
• 2.1 实验动物和支架材料40-41
• 2.2 主要试剂41
• 2.3 主要仪器41
• 3 实验方法41-45
• 3.1 实验动物的饲养41
• 3.2 动物创面模型的建立和移植物移植41-42
• 3.2.1 新西兰大白兔耳廓全层皮肤缺损模型的建立41-42
• 3.2.2 新西兰大白兔外耳道内壁全层皮肤缺损模型的建立42
• 3.3 实验动物取材和组织形态学的比较实验方法42-43
• 3.3.1 三组动物创面大小比较42
• 3.3.2 三组动物创面组织炎症和愈合后瘢痕情况的比较42-43
• 3.4 创面相关细胞因子表达情况检测43-44
• 3.4.1 蛋白样品的提取43
• 3.4.2 蛋白含量的测定43
• 3.4.3 SDS-PAGE电泳43-44
• 3.4.4 转膜44
• 3.4.5 封闭44
• 3.4.6 免疫反应44
• 3.4.7 化学发光44
• 3.5 统计44-45
• 4 结果45-46
• 4.1 大体观察45
• 4.2 组织学HE染色45-46
• 4.3 外耳道内壁创面相关细胞因子表达情况46
• 5 讨论46-49
• 5.1 移植物促进创面愈合及作用机制46-48
• 5.2 动物模型的选择48-49
• 附图49-56
• 结论56-57
• 参考文献57-66
• 附录66-68
• 致谢68-69
• 综述一69-77
• 参考文献73-77
• 综述二77-87
• 参考文献84-87

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本文编号：552411