二维和三维诱导的人胚胎干细胞来源RPE细胞的生物学特性比较研究

发布时间：2017-08-07 01:05

  本文关键词：二维和三维诱导的人胚胎干细胞来源RPE细胞的生物学特性比较研究

  更多相关文章： hESC RPE细胞 二维诱导分化法 三维诱导分化法 视网膜色素变性 RCS大鼠 细胞移植

【摘要】：研究背景和目的视网膜色素变性(retinitis pigmentosa,RP)是由视网膜色素上皮(retinal pigment epithelial,RPE)细胞和视网膜光感受器细胞变性引起的遗传性致盲眼病。目前,RP的治疗尚没有明确有效的方法。RPE细胞移植是目前治疗RP最有远大前景的治疗方法。用于移植的RPE细胞大多来源于早期自体和同种异体RPE细胞及胚胎RPE细胞[1-5],存在细胞来源受限、RPE细胞活性差、免疫排斥反应及严重手术并发症等诸多问题,限制了其临床推广。近年来多能干细胞来源的RPE细胞因其来源广泛、生物学特性良好而渐渐成为RPE细胞移植的主要来源。2012年和2015年Schwartz等[6,7]两次报告使用人胚胎干细胞(Human embryonic stem cells,hESCs)来源的RPE细胞(通过自发分化方法,本文以下统称为二维诱导分化法)移植治疗两类视网膜变性疾病:年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration,AMD)和Stargardt黄斑营养不良,均证实了hESCs来源的RPE细胞的安全性和有效性,这是hESCs来源的RPE细胞临床移植的首次报道,揭开了人胚胎干细胞临床转化研究的序幕。胚胎干细胞分化为RPE细胞有多种方法,各方法诱导得到的RPE细胞的纯度、活性、功能以及获得的效率都有很大差别。近年来采用无血清培养,可将小鼠或人胚胎干细胞诱导的拟胚体(Embryoid bodies,EBs)样聚集体在特制的V字底培养皿结合基质胶培养条件下快速再聚集,配合低浓度生长因子,可以有效地促进ESCs向类器官发育[8,9]。从这类胚胎干细胞来源的类器官中可以获得包括RPE细胞在内的各类治疗细胞。由于这种全新的三维诱导分化法模拟了器官的体内发育过程,从这种诱导方法得到的治疗细胞被认为可能具有更好的生物学特性、更接近原代分离的治疗细胞,但目前尚未见将hESCs经传统的二维诱导分化法和经上述三维诱导分化法得到的RPE细胞(即2D-RPE和3D-RPE细胞)的生物学特性进行系统比较研究的相关报道。本研究拟首先建立hESCs的三维视泡视杯诱导方法,从中分离出RPE细胞,观察RPE细胞的三维诱导分化过程并进行生物学鉴定,并与传统的二维诱导分化法获得的hESCs来源的RPE细胞在成熟度、细胞功能、移植后对变性视网膜的保护功能等方面进行比较,以明确三维诱导分化法获得RPE细胞的特性,为临床选择合适的诱导方式提供依据。方法1、二维分化法诱导人胚胎干细胞为视网膜色素上皮细胞(2D-RPE细胞)(1)H1人胚胎干细胞的培养与鉴定;(2)2D-RPE细胞诱导过程中细胞的形态学变化研究;(3)2D-RPE细胞免疫荧光鉴定,通过分析Bestrophin、CRALBP、MITF和PAX6特异性标记物的表达,鉴定2D-RPE的成熟程度。2、三维法诱导人胚胎干细胞分化为视网膜色素上皮细胞(3D-RPE细胞)(1)3D-RPE细胞诱导过程中细胞的形态学变化研究;(2)3D-RPE细胞免疫荧光鉴定,通过研究Bestrophin、CRALBP、MITF和PAX6特异性标记物的表达,鉴定3D-RPE的成熟程度。3、比较3D-RPE和2D-RPE细胞的生物学特性(1)免疫荧光染色比较3D-RPE和2D-RPE细胞在诱导40d、60d和100d后细胞PAX6的表达差异,并比较PAX6阳性细胞率,以比较3D-RPE和2D-RPE中RPE前体细胞的阳性率差异。(2)通过免疫荧光染色和免疫印迹法,比较3D-RPE和2D-RPE细胞在诱导40d、60d和100d后成熟RPE细胞标记RPE65的表达情况,以明确两种不同诱导方法中成熟RPE细胞的比例差异。4、观察3D-RPE和2D-RPE细胞移植慢性视网膜色素变性大鼠模型(Royal college of surgeon,RCS)后的安全性和有效性(1)通过Ki67、mitochondrial和Dil共标记移植后4w的细胞,观察细胞在体内的增殖情况;将3D-RPE、2D-RPE细胞和hESC细胞分别移植SCID免疫缺陷小鼠腹股沟两侧皮下,每周观察皮下情况至4个月,观察畸胎瘤的形成情况。(2)通过RPE65、mitochondrial和Dil共标记移植RCS大鼠视网膜下腔后4w的3D-RPE和2D-RPE细胞,观察细胞在体内的存活情况;同时采用Rhodopsin染色测量移植3D-RPE和2D-RPE细胞后4w、8w和12w RCS大鼠视网膜的外核层厚度、ERG电生理检测b波幅值,以分析3D-RPE和2D-RPE细胞移植对变性视网膜保护作用的差异。结果H1的鉴定(1)hESCs传代后第一天,细胞单个或多个生长,细长呈分支状;第二天换去含Y-27632的培养液后,hESC细胞呈小克隆成团生长并逐渐增大,克隆团之间逐渐接触融合;(2)培养的hESCs表达胚胎干细胞特异性标记物Nanog、SSEA-4、SOX2和OCT4,除SSEA-4表达在hESC细胞膜上外,其余胚胎干细胞标记物均表达在细胞核,阳性率均在99%以上。2、hESCs经二维诱导和三维诱导分化为RPE细胞的过程和形态比较(1)hESCs通过二维诱导和三维诱导分化法向RPE细胞分化,诱导时间过程和所得的RPE细胞形态相似,20d在2D和3D培养诱导体系中都可以观察到少量棕褐色的色素灶出现并逐渐增多增大,颜色由浅至深;挑出的RPE细胞在60d均呈典型的六角鹅卵石样上皮细胞形态,呈单层片状,富含色素颗粒,细胞排列整齐且连接紧密;(2)3D-RPE和2D-RPE细胞诱导后60d均表达RPE特异性细胞标记物Bestrophin、CRALBP、MITF和PAX6,Bestrophin和CRALBP主要表达在RPE细胞膜上,少量细胞浆着色,整个RPE细胞出现较规则的网状结构。MITF和PAX6定位于RPE细胞核,阳性率均在99%以上;在诱导后40d、60d和100d,3D-RPE中PAX6阳性细胞阳性率维持时间较2D-RPE更长,而RPE65在3D-RPE细胞中出现时间较2D-RPE细胞晚;提示3D-RPE较2D-RPE成熟更晚。(3)hESC经三维分化法形成的视泡样结构经切片染色,可在该结构中发现视网膜神经上皮层和色素上皮细胞的标记物PAX6、CRALBP,并在该结构的外层发现呈单层的视网膜色素上皮细胞,该结构内层部分为多层视网膜神经上皮细胞,提示hESC经三维分化可形成类似视杯的结构,该诱导过程类似视网膜发育过程;3、3D-RPE和2D-RPE细胞移植的安全性及对RCS大鼠视网膜的保护作用(1)3D-RPE和2D-RPE细胞皮下注入重度结合免疫缺陷(SCID)小鼠腹股沟两侧,随访4个月里未发现在皮下形成包块,而阳性对照组的hESC细胞在注射后1个月在腹股沟出现明显的皮下包块,提示3D-RPE和2D-RPE无成瘤性。(2)3D-RPE和2D-RPE细胞移植到RSC变性大鼠视网膜下腔4w后,植入细胞可以形成单层,这些植入细胞人类线粒体和Dil细胞红色标记共表达,提示移植细胞可以存活,未发现明显的排斥反应;(3)植入的3D-RPE和2D-RPE细胞在4w时,Ki67均为阴性,提示移植细胞在体内处于静止期,并没有继续增殖;(4)体外实验3D-RPE-60D细胞不表达RPE65,而2D-RPE-60D细胞RPE65呈阳性。3D-RPE-60D和2D-RPE-60D细胞移植到RSC变性大鼠视网膜下腔4w后均能共表达成熟标记物RPE65,这表明3D-RPE-60D会在体内由不成熟趋向成熟;(5)3D-RPE-60D细胞移植RCS变性大鼠视网膜下腔后4w、8w和12w ERG检测中b波幅值都优于PBS注射组和未处理组,4w时对感光细胞层的保护作用最强,8w、12w有所下降,经视网膜外核层厚度和ERG检测发现,3D-RPE-60D与2D-RPE-60D细胞相比,对RCS大鼠视网膜的保护作用差异不显著。结论1、人胚胎干细胞在三维诱导和二维诱导为RPE细胞过程中,色素灶形成、细胞传代效率、RPE相关蛋白表达等生物学特性均相似,但3D-RPE细胞出现色素颗粒的时间较晚、PAX6表达时间较长,而RPE65表达时间出现较晚,提示3D-RPE细胞较同时间段的2D-RPE更为年轻、幼稚,处于前体细胞阶段。2、SCID免疫缺陷小鼠腹股沟畸胎瘤实验观察,发现3D-RPE和2D-RPE均不成瘤。3、RPE细胞移植到RCS大鼠视网膜下腔后,检测视网膜感光外核层厚度和ERG电生理视功能,发现3D-RPE和2D-RPE对RCS大鼠变性视网膜的保护作用没有明显差异。
【关键词】：hESC RPE细胞 二维诱导分化法 三维诱导分化法 视网膜色素变性 RCS大鼠 细胞移植
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R774.1
【目录】：

• 缩略语表4-5
• 英文摘要5-10
• 中文摘要10-14
• 第一章 前言14-18
• 第二章 人胚胎干细胞经两种方法诱导为RPE细胞的生物学特性研究18-38
• 2.1 二维分化法诱导人胚胎干细胞为视网膜色素上皮细胞（2D-RPE）的研究18-24
• 2.2 三维分化法诱导人胚胎干细胞为视网膜色素上皮细胞（3D-RPE）的研究24-29
• 2.3 二维和三维方法由h ESCs诱导得到的RPE细胞的生物学特性的比较研究29-38
• 第三章 两种方法诱导人胚胎干细胞来源的RPE细胞对RCS大鼠视网膜的保护作用差异38-49
• 3.1 人胚胎干细胞经二维和三维方法诱导衍生的两种RPE细胞移植治疗RCS大鼠的安全性研究38-42
• 3.2 人胚胎干细胞经二维和三维方法诱导衍生的两种RPE细胞移植治疗RCS大鼠的有效性研究42-49
• 全文结论49-50
• 参考文献50-53
• 文献综述 人胚胎干细胞来源的视网膜色素上皮细胞治疗视网膜变性疾病的研究进展53-64
• 参考文献60-64
• 研究期间发表的文章64-65
• 致谢65

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本文编号：632167