IL-1β诱导人角膜上皮细胞产生IL-6和IL-8的分子机制及地塞米松对其抑制作用的研究

发布时间：2017-08-31 09:25

  本文关键词：IL-1β诱导人角膜上皮细胞产生IL-6和IL-8的分子机制及地塞米松对其抑制作用的研究

  更多相关文章： IL-1β 人角膜上皮细胞 炎症 IL-6 IL-8 MAPKs NF-κB 地塞米松 IL-1β MKP-1

【摘要】：第一部分 IL-1β诱导人角膜上皮细胞产生IL-6和IL-8的分子机制研究背景：IL-1β是一种促炎细胞因子,它在调控固有免疫反应和适应性免疫应答中均发挥了重要作用。研究表明在多种角膜炎症性疾病患者的泪液和角膜组织中,IL-1β水平有明显升高(和正常对照比较),如单疱病毒性角膜炎、细菌性角膜炎、角膜热/化学烧伤、胬肉和角膜移植排斥等。此外,IL-1β可以诱导角膜上皮细胞,角膜基质细胞和角膜内皮细胞产生多种炎症因子,包括IL-6, IL-8, TNFa, COX2, iNOS, MCP-1, MIP-3和ICAM-1等,提示IL-1β广泛地参与了角膜的炎症过程。IL-6和IL-8是两种重要的炎症效应分子。IL-6是多功能的细胞因子,它同时具有促炎和抗炎作用。IL-8是白细胞的趋化因子和活化因子。正常情况下,角膜组织和泪液中几乎检测不到IL-6和IL-8的表达。然而,多种角膜炎症性疾病患者的泪液和角膜组织中检测到了IL-6和IL-8的高表达(和正常对照比较),提示这两种炎症细胞因子在角膜炎症中也扮演了重要的角色。多种促炎细胞因子、细菌和病毒产物等都能够快速而显著地诱导IL-6和IL-8的表达,其中IL-1β是其主要的诱导因子。已知MAPKs信号通路和促炎转录因子NF-κB在介导IL-1β诱导产生IL-6和IL-8中均有着非常重要的作用。既往研究表明IL-1β可以诱导体外培养的SV40转化的人角膜上皮细胞(SV40-HCECs)及原代培养的HCECs表达IL-6和IL-8,无论是mRNA水平还是蛋白质水平均有显著升高,然而IL-1β调控HCECs产生IL-6和IL-8的分子机制尚未清楚。目的：本实验组旨在揭示IL-1β诱导HCECs产生IL-6和IL-8的分子机制,主要以三条经典的MAPKs信号通路,即ERK, p38和JNK信号通路,以及转录因子NF-κB为分子靶点,研究其在IL-1β诱导HCECs产生IL-6和IL-8中的作用以及IL-1β活化的三条MAPKs信号通路与IL-1β诱导的NF-κB亚基p65入核和IL-1β上调的NF-κB转录活性之间的内在联系。方法：通过实时定量聚合酶链反应(qPCR)技术检测给予和不给予IL-1β刺激的HCECs IL-6和IL-8 mRNA水平,以及抑制三条MAPKs信号通路和转录因子NF-κB后,再给予IL-1β刺激的HCECs IL-6和IL-8 mRNA水平。采用Western blot技术检测给予和不给予IL-1β刺激的三条经典的MAPKs信号通路及NF-κB抑制因子IκBα的磷酸化水平。通过细胞免疫荧光染色技术检测给予和不给予IL-1β刺激的HCECs NF-κB亚基p65的亚细胞定位以及分别单独抑制三条MAPKs信号通路后再给予IL-1β刺激的HCECs p65的亚细胞定位；行双荧光素酶报告基因检测技术检测给予和不给予IL-1β刺激的HCECs NF-κB的转录活性及分别单独抑制三条MAPKs信号通路后再给予IL-1β刺激的HCECs NF-κB的转录活性。结果：IL-1β显著上调HCECs IL-6和IL-8 mRNA水平,呈时间依赖性和浓度依赖性。IL-1β上调了HCECs中三个经典MAPKs的磷酸化水平；分别单独抑制p38和JNK信号通路或两两联合抑制ERK1/2, p38和JNK信号通路都可以抑制IL-1β对HCECs IL-6 mRNA水平的上调；而分别单独抑制或两两联合抑制ERK1/2, p38和JNK信号通路都可以抑制IL-1β对HCECs IL-8 mRNA水平的上调。IL-1β上调了HCECs NF-κB抑制因子IκBα的磷酸化水平；IL-1β可以诱导p65入核并上调NF-κB的转录活性。抑制NF-κB的活化可以显著抑制IL-1β对HCECs IL-6和IL-8 mRNA水平的上调。分别单独抑制ERK1/2, p38和JNK信号通路不能抑制IL-1β对HCECs p65的诱导入核。单独抑制p38信号通路能部分抑制IL-1β对HCECs NF-κB转录活性的上调,而分别单独抑制ERK1/2和JNK信号通路没有抑制IL-1β对HCECs NF-κB转录活性的上调。创新性结论：1.p38, JNK和NF-κB信号通路介导了IL-1β诱导HCECs产生IL-6；2.ERK1/2, p38, JNK和NF-κB信号通路介导了IL-1β诱导HCECs产生IL-8；3.p38信号通路介导了IL-1β对HCECs NF-κB转录活性的上调。第二部分地塞米松抑制IL-1β诱导人角膜上皮细胞产生IL-6和IL-8的作用机制研究背景：地塞米松是一种合成的长效糖皮质激素,因具有显著的的抗炎作用而被广泛地用于治疗多种免疫性和炎症性疾病。在眼科,地塞米松也被广泛地用于治疗多种炎症性眼病并取得了很好的疗效,如葡萄膜炎、增值性玻璃体视网膜病变、视网膜下新生血管和Mooren's角膜溃疡等。地塞米松的抗炎机制非常复杂,主要有两方面：抑制炎症基因表达和诱导抗炎蛋白基因表达(如MKP-1)。地塞米松抑制炎症基因表达的调控方式还可分为基因依赖和非基因依赖两种,其中基因依赖的方式又可进一步分为直接和间接两种。地塞米松基因依赖的间接抑炎作用主要是通过诱导表达多种负调控因子从而抑制多条信号通路的活化和转录因子的活性来实现的。例如,地塞米松可以通过诱导IκBα的表达来抑制NF-κB活性进而抑制炎症基因的表达；地塞米松还可以通过诱导丝裂原活化的蛋白激酶磷酸酶-1(MKP-1)的表达来抑制多条MAPKs信号通路的活化进而抑制炎症基因的表达。MKP-1是三条经典的MAPKs信号通路的负调控因子,通过去磷酸化活化的MAPKs使其失活,在调控MAPKs信号通路的活化强度和持续时间上有着重要作用。已知三条MAPKs既可以从转录水平正向调控炎症因子的诱导表达,也可以通过转录后修饰增强多种炎症因子mRNA的稳定性,提示地塞米松抑制的MAPKs信号通路可以间接地从转录水平和转录后水平负向调控炎症因子的诱导表达。既往研究显示地塞米松可以抑制IL-1β诱导人角膜上皮细胞和人角膜成纤维细胞产生多种细胞因子和趋化因子(如IL-6和IL-8),但是其具体的分子机制还不清楚。基于前述的理论依据,再结合第一部分实验中已经证实的三条经典的MAPKs信号通路参与调控了IL-1β诱导HCECs产生IL-6和IL-8 mRNA,我们推测地塞米松抑制IL-1β诱导HCECs产生IL-6和IL-8部分是通过诱导HCECs表达MKP-1产生进而抑制MAPKs信号通路介导的。目的：探索地塞米松抑制IL-1β诱导HCECs产生IL-6和IL-8是否通过诱导MKP-1产生进而抑制MAPKs信号通路介导的。方法：通过qPCR技术检测地塞米松对IL-1β诱导HCECs产生IL-6和IL-8 mRNA的影响及地塞米松对HCECs MKP-1 mRNA表达的影响；采用Western blot技术检测地塞米松对IL-1β诱导的HCECs三条MAPKs信号通路的影响。结果：地塞米松部分抑制了IL-1β对HCECs IL-6和IL-8 mRNA水平的上调。地塞米松能够抑制IL-1β对HCECs ERK1/2, p38和JNK信号通路的磷酸化。地塞米松上调了HCECs MKP-1的mRNA水平,呈时间依赖性。结论：初步实验表明地塞米松抑制IL-1β诱导HCECs产生IL-6和IL-8 mRNA可能部分是通过诱导MKP-1的表达从而抑制三条经典的MAPKs信号通路介导的。
【关键词】：IL-1β 人角膜上皮细胞 炎症 IL-6 IL-8 MAPKs NF-κB 地塞米松 IL-1β MKP-1
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R772.2
【目录】：

• 致谢4-5
• 中文摘要5-10
• 英文摘要10-17
• 主要缩略词表17-20
• 第一部分 IL-1β诱导人角膜上皮细胞产生IL-6和IL-8的分子机制20-80
• 引言20-25
• 1 材料与方法25-51
• 2 结果51-64
• 3 讨论64-68
• 4 创新性结论68-69
• 5 本实验不足之处和改进方法69-71
• 参考文献71-80
• 第二部分 地塞米松抑制IL-1β诱导人角膜上皮细胞产生IL-6和IL-8的分子机制80-101
• 引言80-83
• 1 材料与方法83-87
• 2 结果87-91
• 3 讨论91-93
• 4 结论93-94
• 5 本实验不足之处及改进方法94-95
• 参考文献95-101
• 综述101-124
• 参考文献111-124
• 作者简介及硕士研究生阶段取得的成果124

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前3条

1 Yong-ming ZHANG;Shuang-qing WU;Yu-feng YAO;;Long-term comparison of full-bed deep anterior lamellar keratoplasty and penetrating keratoplasty in treating keratoconus[J];Journal of Zhejiang University-Science B(Biomedicine & Biotechnology);2013年05期

2 曾军,姜德咏,刘湘平,唐罗生;基质金属蛋白酶在翼状胬肉的表达[J];眼科学报;2004年04期

3 文智伟,刘祖国;白细胞介素1家族在翼状胬肉上皮内的异常表达[J];眼科学报;2003年02期

，

本文编号：764773